质粒DNA的提取和纯化实验报告

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化

一、实验目的：

1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

2、初步了解DNA纯化的原理。

二、实验原理

1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

三、实验步骤

1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）

2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。

3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）

4、重复一次第三步的过程

5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠

7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min

8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）

9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管

10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min

11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清

12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥

13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等

实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术

2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理

1、关于电泳技术：电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

2、琼脂糖凝胶电泳条带的观察：通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA 的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA 片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳

时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。

3、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA 分子泳动速率不一样，可以进行分离。未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。

4、质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：

①超螺旋DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA 链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

②线性DNA：当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。

③开环DNA：在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。

三、实验步骤

1、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。

2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

3、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

4、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面