蛋白质多重标记

只标记一个或几个伯胺基团？

不确定性！！！
产物会非常多 N个标记位点 会产生2n-1种标记产物
在电泳时 自然泳动速度有差异 谱带展宽非常严重
FQ+蛋白质→FQ蛋白质复合物

FQ蛋白质复合物+FQ→2FQ蛋 白质复合物 ······
影响反应的因素：

反应的温度 蛋白质的结构 FQ的浓度 反应时间 。。。

M↑，D ↓ ，N↑
评价峰展宽（柱效）
衡量CE系统性能
N与E成正比，E越大，柱效越高 由于溶质在较高的电压下，以较快的速度通过柱子， 纵向扩散小（百万）
HPCE适合于分离分析生物大分子（扩散系数小）
电泳淌度μep （electrophoretic mobility，迁移率）： 单位电场下离子的电泳速度
研究方法
1、用5 mM硼酸盐和 3.7 * 10 -5 M溶解的GFP、1.5mm氰化钠加入100 nmol干FQ配成10微升，分别进行三组然后室温孵化1、5、10分钟。
NO.4
2、立即稀释4个数量级，以熄灭这个反应。 3、在加上无处理GFP共四种溶液通过氩离子激光然后通过带有硼 酸缓冲液未涂覆的毛细管的毛细管带电泳分析。
分析化学
阅读研讨
专业：医学检验
阅读文献
Multiple Labeling of Proteins
Design of 3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxaldehyde as a Reagent for Ultrasensitive Determination of Primary Amines by Capillary Electrophoresis Using Laser Fluorescence Detection
目录 contents
3
4
层次和逻辑
研究方法
5
分析实验数据
6
存在不足

论文主题
TOPIC
论文主题
毛细电泳法测定的蛋白质往往都需要荧光标记,实验发现 多重标记的荧光蛋白电泳谱带较天然蛋白的电泳谱带而 言明显变宽。
NO.1
论文主题
本文通过观察比较区带电泳法测得天然绿色荧光蛋白和FQ 标记的绿色荧光蛋白的谱带，证明多重荧光标记导致谱带 变宽并分析其原因。
蛋白质中除N端伯胺外

还存在大量赖氨酸残基
从而使标记反应可能发生

赖氨酸的ε-氨基
对于GFP来说

238个 氨基酸
一个N端的伯胺 + 20个赖氨酸残基
FQ如何标记GFP？
如果标记GFP中所有的伯胺基团？

理论上可行 而且如果能同时快速标记所有 就不会存在展宽严重问题 但实际这实际非常复杂 在赖氨酸上百个的蛋白质中 这种方法难度太大 无法做到
综上，得到两点结论 : 一、物质敷浴的时间是导致峰变宽的一个因素，此次实 验中一分钟时最佳敷浴时间。 二、标记物的数量会影响蛋白质数量的检测，是导致峰 带变宽又一因素
NO.5
⑥
存在不足
存在不足
1、没有给出有效解决荧光标记蛋白的多重附着导致峰展宽 的办法。
2、用了单一的FQ染色而没有对其他标记物进行考虑和探究 。

ep
ep
E
ep

Q E 6r
ep
ep
E
表述物质电泳特性的参数，与粒子
Q 6r
电荷、大小、介质粘度等有关
分离度
R 1 4 2

A
B
ELd
DL A, B eo
影响分离度的主要因素；工作电压；毛细管 有效长度与总长度比Ld/L；表观淌度差。 分离度可按谱图直接由下式计算：
4、进行分析图谱证明本文观点
⑤
分析实验数据
分析实验数据
运用FQ标记的蛋白，通过不同反应时间（分别为 1min， 5min，10min ）的光谱图可知，1min时，分出五个峰，其 他时间峰聚集在一起，没有分析意义。 在一分钟的光谱图中，还检测发现检测物流动性与标记物 数量呈线性负相关。
NO.5
析实验数据
K inetics and apparent activation energy of the reaction of the fluorogenic reagent 5-furoylquinoline-3-carboxaldehyde with ovalbumin
1 2
论文主题
研究内容如何支持主题
2(t 2 t1 ) R W2 W1

反应条件
FQ:

FQ用来做什么？
检测蛋白质时大多需要衍生

FQ是一种用于标记蛋白质的化学物 质
文献针对FQ对荧光蛋白（GFP）的 标记进行研究
FQ如何标记GFP？
＋

FQ 与氨基酸的反应实际是与伯胺的反应
一个蛋白质分子中存
在伯胺基团有哪些？
NO.1

研究内容支持主题
研究内容如何支持主题?
文中提出大多数标记蛋白无法区分结合在赖氨酸残基上N末端的胺和组胺，
NO.2
实验通过跟踪绿色荧光蛋白和FQ的反应，发现在10min反应下，标记分子
和有多个标记物附着，即多重标记，导致谱带展宽。

层次逻辑
层次&逻辑
开头-- 摘要：介绍了文章的基本内容 介绍了实验研究的背景知识
时间： 反应时间越长

与蛋白质结合的FQ越多 蛋白质与FQ生成复合物越多
出峰展宽越严重

如何解决这一问题？

THANK YOU
普遍认为，这一峰展宽来自多个蛋白质标记。大多数标签 反应依赖于攻击伯胺的试剂。这些试剂不能有效区分结合 在赖氨酸残基上的N末端胺和其他区胺。
标签通常可能会去完成一个产生复杂混合物的标记反应 ，使得蛋白质的构象变化，然后异构反应产物有不同的 迁移率，在电泳过程中蛋白质能带增宽。
研究方法
NO.4
为证明文章所述，通过控制变量来进行试验。
NO.6

基本原理
迁移时间：
HPCE具有电化学的特性和色谱分析的特性

有关色谱理论均适用
eo
eo
E

Ld tE
t
app
Ld L V
V ：外加电压； μapp：表观淌度；
L：毛细管总长度； Ld：毛细管有效长度；
分离效率（理论塔板数N） 在空心HPCE中，仅存在纵向扩散
NO.3
（如毛细管电泳，荧光标记以及它们可能出 现的误差） 引出论文的关键词和大概内容 叙述实验的过程与数据 对数据进行分析和讨论 例举本文得到的肯定，增强文章的说服 力
层次&逻辑
NO.3
文章脉络清晰，逻辑清楚。
④
研究 方法
研究方法
荧光标记通常用于提高毛细管电泳蛋白质分析的灵敏度。
NO.4
然而，与天然蛋白质的吸收检测法比较，柱前标签经常导 致不良的电泳分辨率。