UVB辐射导致斑马鱼早期胚胎发育异常和DNA损伤的初步研究

UVB辐射导致斑马鱼早期胚胎发育异常和DNA损伤的初步
研究
闫永健;赵海滨;郭炳冉;王雯雯;刘洁;罗在礼;时永香
【摘要】为研究UVB辐射对斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎发育的影响,采用波长302 nm,强度分别为120、240、310、420 μW/cm~2的UVB照射斑马鱼早期发育阶段的胚胎,照射时间分别为1、3、5、10 min,用于研究UVB照射对形态学及DNA损伤的影响;将原肠期、体节期胚胎及孵化后2 d仔鱼经UVB照射,设立未经UVB照射组为对照组,观察记录UVB照射后胚胎发育情况,统计死亡率、畸形率;应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术检测不同UVB照射条件对DNA损伤的影响.结果表明:(1)IJVB照射对斑马鱼早期胚胎发育形态有明显的影响,能够造成尾部弯曲、围心腔扩大、脊柱扭曲等多种畸形甚至死亡;(2)在检测UVB照射与DNA损伤的关系时,发现UVB照射对胚胎细胞中的DNA能够产生比较明显的损伤,且DNA损伤随照射强度的增加和照射时间的延长而加剧.在所研究的3个发育阶段中,原肠胚受损最为严重,但未发现明显的剂量累积效应.结论认为,UVB照射对斑马鱼早期胚胎发育有明显影响,不同的照射强度和时间造成的影响差异显著;不同发育阶段的斑马鱼胚胎对UVB照射的耐受程度也不同.
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2010(017)001
【总页数】9页(P69-77)
【关键词】UVB;斑马鱼;胚胎发育;DNA损伤;单细胞凝胶电泳技术(SCGE)
【作者】闫永健;赵海滨;郭炳冉;王雯雯;刘洁;罗在礼;时永香
【作者单位】山东大学生命科学学院,山东,济南,250100;曲阜师范大学,生命科学学院,山东,曲阜,273165;山东省临沂市畜牧局,山东,临沂,276004;山东大学生命科学学院,山东,济南,250100;曲阜师范大学,生命科学学院,山东,曲阜,273165;山东大学生
命科学学院,山东,济南,250100;山东大学生命科学学院,山东,济南,250100;山东大学生命科学学院,山东,济南,250100;山东大学生命科学学院,山东,济南,250100
【正文语种】中文
【中图分类】S91
紫外线是波长100～400 nm的电磁波，主要分为3个波段。

中波段紫外线（280～320 nm），即UVB，处于紫外线的生物有效辐射范围（280～400 nm）之内[1]，是对地球生物影响最大的紫外区间，对生物体可产生众多的生物学效应。

适量的UVB照射是生物体维持正常的生命活动所不可缺少的，如可以促进骨骼中钙的吸收，但过量的UVB照射会对生物体产生损害。

一般来说，阳光中的UVB
大部分被臭氧层吸收，但是近年来人类活动产生的氧化氮和卤代烃等化学物质破坏了臭氧层，导致地球表面的UVB辐射不断增强，对生物圈造成了严重的危害[2]，并且威胁到人类的生存。

UVB的波段在核酸和蛋白质的最大吸收峰附近，其光子能量被这些大分子吸收后
所发生的光化学反应，会对生物体产生较为明显的影响。

Bonaventura等[3]的研究发现，UVB照射能够阻碍海胆骨的正常发育，也有文献报道UVB在两栖类动物早期发育阶段有明显的致死和致畸作用，大气中UVB的增加是导致两栖类种群数量减少的重要原因之一[4]。

UVB辐射对植物也能产生严重的损害作用，如可以破坏植物的DNA，影响光合作用[5]，减弱其自身的防护作用，抑制生长等[6]。

斑马鱼（Danio rerio）是一种模式脊椎动物，其产卵周期短，行体外受精、体外
发育，是研究光辐射影响胚胎发育的1种理想材料。

斑马鱼的基因组与人类基因
组的相似性非常高，所以对其进行研究对人类自身也有较大的借鉴意义。

本研究用波长为302 nm的中波紫外线对斑马鱼特定发育时期的胚胎及仔鱼进行照射，观察记录了UVB照射对正常生活状态下胚胎发育的影响，并用碱性单细胞凝胶电泳（Single cell gel electrophoresis，SCGE）技术对受精后 6 h（6 hours post fertilization，6 hpf），24 h（24 hpf）的胚胎和出膜2 d的仔鱼3个阶段细胞中的DNA损伤进行检测，以期为环境保护生物学提供借鉴。

AB系斑马鱼由中科院武汉水生所贺江燕研究员惠赠。

荧光显微镜（TE2000，Nikon），紫外灯管（K53-15H，30W）购自南京华强电子有限公司，紫外线强度计（TN-2340）购自泰纳仪器仪表，电泳仪（DYY-8C）购自北京六一仪器厂；肌氨酸钠、溴化乙锭（EB）购自Sigma公司，正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）和Triton X-100购自Amresco公司。

性成熟斑马鱼雌雄分开饲养，水温（28.0!0.5）℃，控制光周期为14 h∶10 h （L∶D）。

每天换水1/3。

饲料为优质的成品鱼食辅以活饵，每天早晚各饲喂1次。

实验前1天，取体格健壮的4尾雄鱼和2尾雌鱼放入产卵缸中（产卵缸条件同上），实验开始后约20 min，雌鱼开始产卵并在水中完成受精过程，收集受精卵于28℃的1/10 Holfreter液中进行孵化，孵化过程中及时挑出死卵。

1.4.1 形态学实验待胚胎发育到原肠中期（约6～7 hpf）时进行UVB照射，每个培养皿中放置50个胚胎。

用 120、240、310、420 μW/cm2 4 个强度 UVB对胚胎进行照射，每个照射强度下又分为1、3、5、10 min 4个照射时间组，同时设无UVB照射为对照组，共17组。

照射完毕后于28℃的1/10 Holfreter液中避光孵化1 d，第2天开始在正常光照条件下孵化，每天更换1/10 Holfreter液1次，每次换1/3，待出膜5 d后进行相关统计。

实验重复3次。

1.4.2 DNA损伤检测实验待胚胎发育至6-7 h（原肠期），24 h（体节期）和出膜2 d时分别照射UVB。

6-7 h的胚胎照射强度和照射时间与上述形态学实验相
同，24 h的胚胎和出膜2 d的仔鱼，分别在420 μW/cm2强度的UVB下照射5 min。

每组15个胚胎，各发育阶段胚胎和仔鱼分别设立无UVB照射对照组。

实验重复2次。

待仔鱼出膜5 d后进行形态学观察与统计，分别统计不同UVB照射条件下胚胎的死亡率、畸形率与严重畸形率，并对典型特征进行拍照。

实验重复3次，结果取平均值。

死亡率=每组死亡个体/每组胚胎数；畸形率=每组畸形个体数/每组存活胚胎数；严重畸形率=每组严重畸形胚胎数/每组存活胚胎数。

畸形判断标准为与正常发育仔鱼形态不同的为畸形仔鱼；脊柱扭曲、发育明显受阻的为严重畸形。

1.6.1 单细胞悬液的制备制作方法参照文献[7]并有所改进。

照射后的胚胎立即放入预冷的玻璃匀浆器中并加入冰冷的匀浆液（0.075 mol/L NaCl，0.024 mol/L EDTA-Na2），匀浆 4次，每次旋转不超过90 °，匀浆后的悬液经200目铜网过滤，滤液在200 g离心力下离心10 min，温度4℃，弃上清，沉淀用冰冷的PBS 重悬，在180 g离心力下离心7 min，弃上清，沉淀用50 μL冰冷的PBS重悬待用。

1.6.2 细胞活力测定用台盼蓝排斥实验检测细胞活力。

制得的细胞悬液与0.5%台盼蓝染液（PBS配制）等体积混合，1 min后计数，当细胞活力大于80%时进行单细胞凝胶电泳实验。

1.6.3 单细胞凝胶电泳载玻片与盖玻片分别用铬酸洗液浸泡24 h和2 h，蒸馏水冲洗晾干保存于95%酒精中待用。

铺胶与电泳过程参照文献[8]并有所改进。

胶用PBS配制，铺胶前先用20 μL 0.75%常熔点琼脂糖（NMA）于铺胶处涂抹均匀后酒精灯烤干，趁热铺第1层胶。

滴加120 μL 0.75% NMA，盖上盖玻片待琼脂糖铺展均匀后放于4℃冰箱冷却10 min。

抽掉盖玻片，滴加细胞悬液与37℃预热的低熔点琼脂糖（LNA）等体积混合液90 μL，铺平，冷却，然后再铺1层NMA。

把带有胶板的玻片放入细胞裂解液（
2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1%肌氨
酸钠，100 mmol/L EDTA-Na2，用前加1%Triton-X 100和10%DMSO）中4℃避光条件下裂解2 h，蒸馏水洗3次，每次5 min。

往电泳槽中注入碱性电泳液（0.3 mol/L NaOH，1 mmol/L EDTA-Na2），放入载玻片，避光静置解旋40 min，电泳20 min（200 mA，25V），于4℃预冷的中和缓冲液（0.4 mol/L Tris）中中和2次，每次15 min。

每个胶板滴加30 μL EB染色液（20 μg/mL），染色 20 min 后进行观察。

1.6.4 显微观察与统计分析使用荧光显微镜进行观察、记录并拍照，每个实验组制作1个胶板，每个胶板上随机取50～60个细胞，实验重复2次，所得图像用CASP软件分析。

形态学部分用百分率作为统计的指标进行分析。

CASP软件所得结果用SPSS 16.0软件进行相关分析和制图。

UVB照射对斑马鱼胚胎发育具有较大的影响，能够造成斑马鱼胚胎的畸形与死亡。

UVB照射造成的斑马鱼畸形主要有尾部弯曲，围心腔扩大，眼前突，而比较严重
的则会出现脊椎扭曲，尾部短小，头部严重变形等（图1）。

研究中发现，照射1 min时，胚胎畸形率与死亡率并没有与照射强度表现出量效关系，而照射3 min
以后，随着UVB照射强度和照射时间的增加，胚胎的死亡率与仔鱼的畸形率均增高（图2、3）。

出现这种现象的原因可能是由于胚胎个体间对短时间UVB照射的抵抗力具有差异性；而随着照射时间的增加，UVB照射对胚胎的损伤加剧，破坏
了胚胎内部的保护机制或使得胚胎保护作用减弱，所以呈现出死亡率和畸形率随照射时间和照射强度增加而增高的现象，最终全部变为畸形甚至严重畸形（图4），死亡率达到100%（图2）。

从图5-7可以看到，UVB照射对斑马鱼原肠胚细胞DNA存在较为明显的损伤作用，且总体上表现出一定的规律性，即在相同的照射强度下随着照射时间的增加DNA损伤加剧（图5）；在相同的照射时间下随着照射强度的增加DNA损伤加
剧（图6）。

从不同实验条件下所得的各组彗星的尾矩分布来看，最小值没有显著
的变化，发生明显变化的是最大值与平均值（图5、6）；在对6 hpf，24 hpf及出膜 2 d这3个发育时期在相同 UVB 照射条件（420 μW/cm2，5 min）下所得到的结果（图7）比较时发现，在各发育时期，对照组与实验组的DNA损伤程度差异明显（P＜0.05）；实验组的DNA损伤程度随发育历时的延长而依次减弱，24 hpf和出膜2 d这2个组与6 hpf组的DNA损伤程度差异明显（P＜0.05），但实验组与对照组DNA损伤的差异随着发育阶段的延后明显缩小。

这充分说明随着发育的进行，个体对UVB的耐受力不断增强。

UVB照射生物体时，光子能量被细胞中的分子或原子吸收，激发电子从基态跃迁到激发态。

许多生物大分子的最大光吸收波长正好与UVB重合，所以容易引发光化学反应，导致一系列生物事件的发生，如细胞DNA的损伤，基因表达的改变，蛋白质大分子的异常以及酶活性的改变等。

UVB对生物体DNA的损伤主要表现为产生某些光产物，主要的2种就是环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和6-4嘧啶光产物（6-4 PPs）以及它们的Dewar异构体，这2类化合物能够对DNA螺旋产生不同程度的弯曲或扭结[9]，减弱DNA双链之间的结合，改变DNA的空间结构，导致DNA链容易断裂，并严重阻碍DNA的复制与转录，产生突变[10-11]。

UVB辐射对细胞周期也有一定的影响，一般来说，UVB照射能够导致细胞周期延长甚至停滞或凋亡[12-13]。

UVB还通过作用于具有免疫功能的细胞（如淋巴细胞），或诱导特定细胞因子的释放来抑制生物体的免疫系统功能，使免疫力下降。

最近的研究表明，紫外线能够通过免疫抑制等机制影响肿瘤的发生和发展[14]，UVB照射能起到免疫抑制剂的作用，代替免疫抑制剂防止小鼠外源性肿瘤的排斥反应。

UVB照射细胞后可以产生大量的活性氧化自由基，同时又抑制了抗氧化酶的活性，这些氧化自由基能够对蛋白质、DNA等产生氧化修饰作用，进而产生更深层次的影响，如改变蛋白质的性能，造成DNA链的断裂和空间结构的改变等。

实验中用不同强度的 UVB（120 μW/cm2、240 μW/cm2、310 μW/cm2
和420 μW/cm2）照射斑马鱼胚胎，研究其对斑马鱼早期胚胎发育及胚胎细胞
中DNA损伤的影响。

结果表明，用相对较低强度的UVB（120 μW/cm2）照射
斑马鱼胚胎，1 min 时死亡率上升，但未发现畸形个体，随着照射时间的延长，畸形率不断上升，但死亡率保持在一个相对平稳的水平，同时检测出一定程度的DNA损伤。

这说明在此UVB强度下照射1 min即淘汰了一些生存力较弱的胚胎。

虽然对DNA造成了一定程度的损伤，但由于激发了胚胎内部的自我保护与修复机制，使损伤在随后的一段时间内没有对其余胚胎产生致死作用；同时由于DNA损伤的不断加剧，使得畸形个体增加。

对本研究形态学与DNA损伤两部分结果进行比较时可以发现，当照射剂量较小时，如1 min或120 μW/cm2，DNA损伤与照射剂量间具有正相关关系，但畸形率
与死亡率并没有表现出对照射强度和照射时间的依赖性；随着照射时间的增加（3 min以上），这种依赖性变得明显。

这说明照射UVB后产生了DNA损伤，而遗
传物质的损伤导致畸形胚与死亡胚的出现。

但损伤产生的同时也激活了体内的保护与修复机制，由于个体间的差异而导致了形态学上的无规律性；而当照射剂量进一步增加时，胚胎细胞中的DNA损伤加剧，破坏了胚胎中的修复机制或超出了胚胎自身的修复能力，所以死亡率与畸形率也呈现出同步升高的趋势。

不过在实验中并没有发现明显的累积效应，这是因为在相同的累积照射量下，照射时间长则意味着胚胎具有更多的时间进行修复，受到的损伤相对就会小一些。

DNA损伤能否得到修复是决定细胞存活或是进入凋亡途径的主要因素[15]。

DNA 的损伤修复机制主要有2种：一是生物体内部的自身修复，二是光修复。

一般情
况下，UVB辐射产生的特异嘧啶产物主要是通过核苷酸切除（Nucleotide excision repair，NER）的方式进行修复[16]。

损伤修复的速度依赖于损伤产生的类型，如在UV导致DNA损伤产生的2种特异嘧啶产物中，6-4 PPs的修复速度要快于CPDs。

UVB照射对生物体产生损伤的同时也引发了生物体内的一些保护
机制，如激活了Caspase-3、P53、磷酸脂酶（PTEN）等调控蛋白或酶对损伤DNA进行修复，若不能修复时就促使细胞进入凋亡通路[17-19]。

光修复的研究最早源于对细菌的UV光复活效应的研究[20]，波长300～500 nm的光线可以激活生物体内的光复活酶，吸收能量的光复活酶能够通过2个辅基把能量传给嘧啶二
聚体，使二聚体解聚变为单体[21-22]。

研究表明，经UVB照射的斑马鱼胚胎紧接着照射UVA，与单纯UVB照射相比其死亡率和畸形率都大大降低[23]。

紫外线与地球生命的关系复杂而又密切，适量照射紫外线对于生物体的生命活动必不可少，但过量的紫外线照射则会造成严重的后果，如植物死亡、动物发育畸形等。

所以合理利用紫外线具有重要的意义。

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