生物技术-基因工程篇

质粒在宿主细胞中的复制有两种类型

严密型质粒：复制需要蛋白质合成和DNA聚合酶 Ⅲ 的存在，它的复制与宿主细胞的增殖密切相关，每个 宿主细胞内只有1~5个严密型质粒。

松弛型质粒：复制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在没有 蛋白质合成的情况下继续复制，每个宿主细胞内可存 有10~200个以上的松弛型质粒，在细胞蛋白质合成及 染色质复制停止的情况下，可继续大量扩增至上千份。
1、化学转化法
受体细胞经一定的化学作用后，细胞膜通透性增加， 处于感受态，称之为感受态细胞（Competent cells）。

Cacl2法：受体菌（如大肠杆菌 E-coli）在低温下（0℃）被
置于低渗的Cacl2溶液中，菌体膨胀成球形。转化体系中的 DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，之后
切点间的片段可以被外源性DNA替代。
2）M13噬菌体（M13 phage）
a. M13噬菌体基因的结构及生活史特点 •单链线性DNA分子，长约6500个核苷酸； •感染大肠杆菌后，单链线性DNA分子可转变成 双链复制型(RF)。从大肠杆菌中分离出双链复制 型的M13还可作为克隆双链DNA的载体； •大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢， 而新的噬菌体被释放到菌体外。 •基因组中有一段长约507个核苷酸的非必需区 (IS)，可以插入外源性DNA。
工具酶

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )
◇能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷 酸酯键，切断分子,水解磷酸二酯键，产生DNA片段 的5′端为P，3 ′端为—OH。
◇ 识别序列的特点 ①专一；②常由4~6个碱基组成； ③具有回文序列
BamH 1 酶-GGATCC-CCTAGG-
杆菌）
•容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。
•重组的λ 噬菌体容易筛选，也容易保存。
d.不利处 λ 噬菌体上有过多的限制性内切酶位点，因此必须对野生 而有目的的在“非生活区”保留1 ～ 2个酶切位点，以满
型λ 噬菌体进行改造，除去基因组“生活区”的酶切位点，
足构建重组载体的需要。
e.经过改造构建后的λ 噬菌体载体有两类 插入型载体：只有一个限制性内切酶位点可供插入外源性 DNA片段。 替代型载体：含有某个限制性内切酶的两个切点，这两个
蓝白筛选
载体中含一个LacZ基因 编码
β-半乳糖苷酶
X-gal(无色) X(蓝色)+gal(半乳糖) 其中X为显色底物：5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷 在含X-gal和Lac操纵子诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的 培养基中 ◆非重组的噬菌体转化的宿主菌可以合成β-半乳糖苷酶，分解Xgal，菌落形成蓝色噬菌斑。 ◆重组的的噬菌体因LacZ基因被外源DNA插入而破坏，故其转化 的宿主菌不能产生β-半乳糖苷酶，因而菌落形成无色噬菌斑。
2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体
•Ti质粒是根瘤土壤杆菌内的质粒，对其改造可 构建成在植物细胞克隆或表达的载体。
3）DNA病毒载体 ——理想的动物细胞基因工程载体
SV40载体（猴肾病毒） • 完整的SV40载体 • 利用SV40元件组建的穿梭质粒载体， 如pSVK3质粒： 由 噬菌体 三种载体构建而成 质粒 乳头瘤病毒载体 SV40 如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿 梭载体。
b.λ 噬菌体感染细菌后有两种生活途径 ◇溶菌性
在细菌中连续增殖直到细菌裂解，释放噬菌体。
◇溶源性 然后传给子代，宿主细胞不发生裂解。 只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。
将其DNA整合入细菌基因组DNA中，与宿主DNA一起复制，
噬菌体的溶源周期和溶菌周期
c.λ 噬菌体作为基因克隆载体的几点好处 •可在体外包装成病毒颗粒，可高效感染宿主细胞（大肠
细菌经42 ℃短时间热冲击处理，此时受体菌可大量吸收其表 面粘附的DNA复合物，完成转化，继而在培养基上生长一定 时间（数小时）后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。
2、物理转化法

电穿孔法 把受体细胞悬浮到含有转移DNA的的平衡液中， 加上瞬间高压脉冲电，使细胞膜和核膜的通透 性改变，一些DNA分子可以进入受体核内而被 表达。

DNA连接酶(DNA ligase )
目的基因
四、重组DNA导入受体细胞
受体细胞
大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、 昆虫细胞 ※受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，使载体或重组 DNA不被水解
细菌细胞作为表达系统 优点： 操作简单、增代时间短、价格低廉； 某些蛋白质的表达水平很高 缺点: 表达多肽分子常不能适当地折叠, 蛋白质常 无 生物活性； 异体蛋白质，常对细菌有毒性作用； 缺乏真核细胞进行转录后修饰的酶，例如使 蛋白质磷酸化、糖基化
③含有多种限制性内切酶单一切点，酶切位点应在复制 子以外适当的位置。
④ 能接纳尽可能大的外源性DNA。外源性DNA 插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。
⑤ 必须有便于筛选的明显标志，如耐药性和空斑 形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出 ⑥ 对受体细胞无害。
⑦ 有促进外源性DNA表达的调控区；
※天然载体有很多缺点，远远达不到理想载体 的要求，通常使用的载体都是经过改造过的载体。
◇ 限制性内切酶都是 从原核生物中发现的。 到目前为止已发现上千 种限制性内切酶，其中 数十种被经常使用。
限制酶的命名
EcoR Ⅰ
细菌的属名 细菌种名 细菌株系 从该细菌中分离出的第几个酶
切口类型：
（1）形成粘末端(cohesive end)：
（2）形成平末端
SmaⅠCCC↓GGG GGG↑CCC
2、载体的种类
质粒（plasmid）
按来源分
噬菌体（phage）
病毒(vector )
按作用分
克隆载体(cloning vector )
表达载体(expression vector)
（1）质粒载体


存在于细菌染色体之外的双链环状小型DNA分 子。
质粒的存在与否一般对细菌的生存没有决定性的影响。 带有选择性遗传标志，如基因的产物可能是降解某些抗 生素的酶。 在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核 细胞或真核细胞均可复制的穿梭质粒（shuttle plasmid）。
腺病毒载体
克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。 表达载体(expression vector) 在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的 载体 , 除克隆载体的特性外还含有启动子、核糖 体结合位点、转录终止信号等。
三、目标基因与载体DNA连接形 成重组体
建的，如M13mp2、mp5、mp7、mp9、mp18、mp19。
具体的改造方法是在野生型M13DNA中人工插入两个核苷 酸顺序：
◇大肠杆菌乳糖操纵子中的控制区和β -半乳糖苷酶基
因（Z基因）。
如果在培养基中加入诱导物异丙基硫代半乳糖苷（
IPTG）和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷（x-gal， 为一种色原），由IPTG诱导而产生的β -半乳糖苷酶可以 使x-gal水解，产生蓝色化合物/蓝色噬菌斑。

分离/制备目的基因 选择载体 使目标基因与载体DNA连接形成重组体


以重组体转化宿主细胞（细菌或其他细胞）
筛选出能够表达重组DNA的宿主细胞，使这些细胞 扩增、繁殖 获得大量拷贝的目的基因 使目的基因在宿主细胞表达出编码的多肽
基 因 工 程 （ 原 核 表 达 系 统 ） 操 作 的 基 本 步 骤
◇利用此原理可在质粒扩增时，加入氯霉素抑制宿 主菌蛋白质合成，达到进一步扩增松弛型质粒的目的。

实际应用的都是人工构建的质粒，其中最 常用的是pBR322 ,pUC19等。
PBR322
4363bp
抗四环素基因
抗氨苄青基因
质 粒 携 带 外 源 基 因
（2）噬菌体载体
感染细菌的病毒 1）λ噬菌体
一、目标基因的制备

1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法） 2、酶促合成法/反向转录法 3、人工合成法 4、通过PCR把目的基因扩增出来
1、限制性针通过分子杂交，从基因库 中分离出含有特定基因的克隆
a.λ 噬菌体的基因结构特点 •双链DNA分子（线性或环形），两端具有12个核苷酸 组成的互补的粘性末端。当λ 噬菌体感染宿主细胞后， 双链线状DNA分子立即通过粘性末端互补连接，封闭成 环。这个粘性末端结合的部位称为COS位点（cohesive end site）。 •具非必需区/非生活区（中间区约1/3长度），此区可 通过遗传工程技术由外源性的DNA所代替。
生物技术之 ——基因工程篇
基因工程(genetic engineering)

基因工程又称DNA重组技术，即在体外把 两种或者两种以上不同来源的DNA分子重 新组合成新的DNA分子，通过载体转入受 体细胞内，将所需要的经过修饰的基因在 受体细胞内表达，产生人类所需要的基因 或产物，或转基因生物。
基因工程的基本步骤
基因工程的应用
农业-用基因工程育种法培养高光效、营养丰富、
耐储藏、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗 除草剂的新品种。
工业-应用基因工程技术创造多功能超级工程菌, 利用工农业下脚料生产乙醇 、沼气、氢气等,不仅 是前程远大的能源,又可以净化环境。
◇插入50bp长的一小段DNA顺序，称为多接头 （polylinker）。在这个接头中约有10多种内切酶割切位
点。由于多接头区位于β -半乳糖苷酶基因中，所以，当
外源性DNA片段克隆到多接头处任何一个切割位点，被转
化的大肠杆菌就不能产生β -半乳糖苷酶，从而在含有
IPTG和x-gal的培养基中产生无色噬菌斑。
b.M13噬菌体作为基因克隆载体的优点 从宿主菌体中释放出来的M13噬菌体粒子只含单链DNA,其
中包含有被克隆的外源性DNA片段中两条中的一条，因此
可用来制备单链DNA探针，也可以用作DNA测序的模板。
c. 对M13噬菌体的改造 野生型M13噬菌体的非必需区中没有常用内切酶的切割
位点。因此，用作载体的M13均是经过一系列改造后而构
2、酶促合成法/反向转录法
mRNA 逆转录
逆转录
cDNA
3、人工合成法
蛋白质的氨基酸序列 按密码子推算 核苷酸序列 化学合成目的基因 ※ 用于结构清楚、分子量较小的基因

利用化学合成法已成功合成人生长激素释放 因子、胸腺素、血管升压素、胰岛素、α干 扰素等基因出来

外源目的DNA一般缺乏直接导入宿主细胞和进 行DNA复制的能力，不能在宿主细胞表达，必 须依赖适当的载体分子。
二、载体的选择

载体（vector）：运载外源性DNA有效地进入 到受体细胞内的工具。
1、 载体应具备的条件 ①是单个复制单元，能在宿主细胞内独立复制自身。 ②分子相对较小（3~10kb），以便从细胞中分离纯化。
◇带有入噬菌体粘性末端；
◇分子小，可容纳大的外源DNA片段。
（4）真核细胞为宿主的克隆载体
1）酵母为宿主的载体
•人工构建的酵母质粒
• 酵母人工微小染色体（YAC）
将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列 （ARS）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记 （HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的 DNA片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞 YAC。
（3）粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒/粘粒/cos质粒
◇是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。
◇ 由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。 ◇在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制， 但不表达噬菌体的任何功能。
cosmid的构造特点:
◇含有抗药标志和复制起始部位；
◇一个或多个单一酶的限制位点；

微量注射法
用微玻璃管通过显微操作直接把纯化的DNA注 入到受体细胞内。
3、转染

用噬菌体或真核生物的病毒作为载体转化细胞 常成为转染。
五、筛选出能够表达重组DNA的 宿主细胞
1、根据载体抗生素抗性基因筛选转化子
2、根据菌落的显色反应筛选转化子
3、营养缺陷型筛选标记 4、电泳、双酶切、测序验证 5、菌落（或噬菌斑）的原位杂交