分子标记

生化标记
生化标记包括同工酶和等位酶标记。（以酶作为标记）
同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的 不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多 种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一
第三代分子标记技术
章丽
SNP
1.什么是SNP? 2.SNP的分类 3. SNP的检测方法
SNP: Single nucleotide polymorphism 个体间基因组DNA序列同一位置单 个核苷酸变异(替换、插入或缺失) 所引起的多态性。
2.SNP的分类
同义cSNP(synonymous cSNP) 基因编码区SNPs（cSNPs） SNP 基因周边SNPs（pSNPs） 非同义cSNP(non-synonymous cSNP) 基因间SNPs（iSNPs）


遗传多样性分析： 筛选出的13条引物共产生104条清晰条 带，其中多态性条带94条，多态百分率为 90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。 结果显示，ISSR分子标记对攀枝花苏铁多 样性的研究效果很好。
最新的分子标记技术 1. RGAs 标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基 因类似物) 2. 3. 4.
什么是遗传标记？
遗传标记genetic marker:指可追踪染色体、染 色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何 一种遗传特性。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性； 因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可 作为遗传标记。
遗传标记的类型
形态学标记（morphological marker）
分子标记的三个阶段
随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分 子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA 分子标记。
第一代分子标记：RFLP;RAPD;AFLP； mtDNA分子标记
第二代分子标记：微卫星（ms）(微卫星DNA)； ISSR 第三代分子标记：SNP(单核苷酸多态性)；EST
此外，在RAPD和RFLP技术基础上建立了
SCAR(Sequence characterized amplified regions，序列特异性扩增区域)， CPAS(Cleaved polymorphic amplified sequence，酶切扩增多态序列)和DAF(DNA amplified finger prints，DNA扩增指纹) 等标记技术。这些技术的出现，进一步丰 富和完善了第一代分子标记，增加了DNA多 态性的研究手段。
ห้องสมุดไป่ตู้
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的 序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
SSR 标记的应用
目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、 大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体 遗传图谱。 这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位 及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、 农作物育种、进化研究等领域。
ISSR的应用举例
——攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析
基因组DNA 的提取
引物
引物筛选
遗传多样性分析
PCR扩增及产物检测： 从所有引物中筛选 出扩增条带晰、稳定性好、特异性强的引 物对48个DNA 样品进行PCR扩增。 引物筛选：从100个ISSR引物中筛选出扩 增产物条带清晰的13条引物。
标 记 技 术 的 基 本 原 理
根据微卫星重复序列两端的特定短序列设 计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由 于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同 长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的 一种有效方法。 微卫星序列在群体中通常具有很高的多态 性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分 子标记。
细胞遗传标记
细胞学标记即植物细胞染色体的变异。
包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些 重要基因的染色体或染色体区域定位。 细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来 培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏 感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。
纯合子的扩增曲线
杂合子的扩增曲线
EST
1.什么是EST 2. EST的技术路线 3. EST的应用 4. EST的测序及分析过程
EST
EST (表达序列标签,Expressed Squence tags)是从一个随机选择的 cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列, 代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到 7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。EST 来源于一定环境下达水平。
2、RAPD
基本原理：用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地
扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。
RAPD标记的特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序
列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技 术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引 物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
定义：SSR （全称为简单序列长度多态性 标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个(多 为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成 的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复, 即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心 序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其 高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记技术和ISSR 标记技术
雷世勇
2.1 SSR 标记技术。
在真核生物基因组中存在许多非编码的重
复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸 的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核 苷酸的微卫星DNA。 小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的 不同位点。由于重复单位的大小和序列不 同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多 态性。
第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列
标签EST标记等。
1、RFLP
基本原理：特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量
不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段。
限制性内切酶识别DNA中特殊的核苷酸序列
不同个 体中的 酶切位 点不同， 所以， 种群具 有限制 性片段 多态性。
SNP的检测方法
测序法 酶切法 荧光PCR法 DNA芯片法 质谱法

针对目标SNP位点，直接设计合适引物扩增得到含突变 位点的PCR产物，经序列测定得到位点信息，属SNP分 析的金标准。
SNP-HRM（High Resolution Melt）熔解曲线分析技术
检测技术原理： 在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内 荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。
般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。
生化标记的应用有限：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技
术有一定难度。
分子标记
分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差 异。分子标记的优越性表现为：
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检 测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。

2.2 ISSR 标记技术

ISSR 即（内部简单重复序列）,是一 种新兴的分子标记技术。它是建立在1994 年发展的一种微卫星基础上的分子标记。 已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、 遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。
几个重要的名词：
ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物, 即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核 苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物 互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进 行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMPPCR。 RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是 ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端 加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为 RAMP 技术 。
目前的分子标记类型
目前的分子标记有三类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括
RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；
第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、
简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记AFLP、序标位 STS、序列特征化扩增区域SCAR等；
用特异性的 限制性内切酶 进行酶切， 得到不同长度 的DNA片段， 这些片段在 跑电泳中 会分离。
限制性片段长度 多态性 通常被人们用来 标记目的基因。
特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受
发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果 稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。

ISSR分子标记的优点

2实验成本低； 3操作简单； 4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。
ISSR 标记技术原理：
用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复 和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了 引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结 合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片 段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍 的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物 的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的 差异。

SSR
SSR分子标记的应用举例
——鹅掌楸种属及杂种的分子标记
鹅掌楸基因组 DNA的提取
北美鹅掌楸EST序 列中开发的 EST-SSR引物
引物筛选
物种特异性扩增
引物特异性验证
引物筛选
随机选取鹅掌、楸北美 鹅掌楸各四个样本 176对引物
PCR扩增
挑选选留扩增条带 清晰且有明显多态 性片段的引物引物8对
用鹅掌楸、北美鹅 掌楸、杂交鹅掌 楸各30个基因型
再次筛选
一对特异性引物
物种特异性扩增
鹅掌楸基因 190bp 筛选的一对引物 特异性扩增 180bp 北美鹅掌楸基因
引物特异性验证
鹅掌楸 杂交鹅掌楸 北美鹅掌楸
与一对引物特异性扩增
190bp
190bp和180bp
180bp
SSR 标记技术的特点有：
3、AFLP
基本原理：AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产
物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种 多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。
AFLP标记的特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶
及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2） 典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同 时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传； （4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂 贵，实验条件要求较高。 。
细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗
传标记，或DNA标记。
形态学标记
形态标记即个体的外部形态特征。 形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多 数有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且 有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获 得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。 主要在早期使用。