甾体激素类药物的分析4

C=O
20位酮基
1700cm-
1
870cm-1
C-H

七、TLC法
八、HPLC
应用 甾体激素类药物原料与 甾体激素类药物原料与制剂
制剂的鉴别
的鉴别（如：醋酸曲安奈德
软膏、醋酸氟轻松软膏）
方法
对照品法
对照品法
要求供试品溶液所显主 要求在含量测定项下记录的
与硫酸显色反应
显 色 荧光 加水稀释 氢化可的松 棕黄色至红色 绿色 黄色至橙黄色
炔雌醇 炔雌醚 泼尼松 泼尼松龙 地塞米松 苯甲酸雌二醇
橙红 橙红 黄→橙 深红 淡红棕色 黄绿色
黄绿 玫红絮状↓
黄绿
红色↓
— 黄色渐变蓝绿色
— 灰色絮状↓
—
颜色消失
蓝色
淡橙色
(2)官能团的呈色反应
1、C3–酮基和C20–酮基
机理：
有机氯原子
水解 加热
无机氯原子
硝酸—硝酸银 AgCl
结合在母核 氧瓶燃烧法
环上的氯原子 破坏
无机氯原子
7、水解产物的反应
适用： 本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯
原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸 酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物 来鉴别。
结果： 醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成
HH
母核有21个碳原子
O
△4–3–酮基 （紫外吸收）
结构修饰
H HO
提高结构稳定性
增强抗炎作用
F
O
OH
O
OH CH3
H
H
CH3 H
OH
O O
O CH3 OH
CH3 H H
醋酸地塞米松
O HO H CH3
CH3 H
ONa
OP O OHH ONa
OH
FH O
曲安息龙
FH O
地塞米松磷酸钠
（二）雄性激素和蛋白同化激素
苯环
其他共轭结构
方法
240nm左右
280nm左右
可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。
示例
曲安息龙
丙酸倍氯米松
溶剂
甲醇
乙醇
浓度
20μg/ml
20μg/ml
在238nm处 在239nm处有最大吸收，A为
结果判断
有最大吸收
0.57～0.60，在239nm与263nm 处的吸收度比值为2.25～2.45
2、C17–α–醇酮基的呈色反应（还原性）
适用：肾上腺皮质激素。
能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制 AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色。 其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可 用作层析法的显色剂，还可用于含量测定.
HO O
CH2OH C=O
OH
＋ 2Cu2+ + 4OH-
应
与亚硝基铁氰 化钠、间二硝
基苯反应
UV、与 重氮苯磺 酸盐反应
第二节 鉴别试验
一、物理常数的测定
二、化学鉴别法
三、制备衍生物测定熔点 四、紫外分光光度法 五、红外分光光度 六、薄层色谱法 七、高效液相色谱法
第二节 鉴别试验
二、化学鉴别法 （一）呈色反应
（1）与强酸的呈色反应 强酸： H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl 原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与 HSO4-作用呈色。
C21
18 C20
12
11
13 17
19 1
C
9
D 16
2
A
10
B
8 14 15
3
5
7
4
6
甾体激素 类药物均 具有环戊 烷骈多氢 菲母核。
分类
肾上腺皮质激素
甾体激素 性激素
雌激素 雄性激素 蛋白同化激素 孕激素
（一）肾上腺皮质激素
C17–醇酮基 （还原性）
O CH2OH
H
HO
OH
天然皮质激素：氢化可的松
（2）氨制AgNO3（多伦试液）的沉淀反应 （3）与AgNO3的沉淀反应
适用：含炔基的甾体激素类药物（炔雌醇、炔诺酮）。 机理：
R C C H + A gN O 3 R C C A g↓ + HNO3
NaOH滴定，电 位法指示终点
（4）与HNO3-AgNO3的沉淀反应
适用：甾体激素类药物C21位上有氯原子取代，如丙 酸氯倍他索。
荧光法
铁-酚试剂比色法
紫外分光光度法
气相色谱法 高效液相色谱
一、HPLC法 USP、BP、JP均采用
测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。
方法：RP－HPLC（内标法）
eg：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相 ODS，检测波长254nm
流动相 甲醇-水（65:35） 内标物 己烯雌酚 系统适用性试验：n>1000，R符合规定。
HH
A环为苯环，C3位上有 酚羟基，C17位上有β-羟基
HO
结构不稳定，口服无效
结构修饰
HO OH
炔雌醇
OH
CCH 乙炔基引入，使 仲醇变叔醇，增 加空间位阻，阻 碍酶对药物的氧 化代谢，可口服
OCOCH2CH2CH2CH3
17位羟基酯化，
酯在体内缓慢水
解，延效
HO
HO
戊酸雌二醇
OH
可口服 高效 长效
有香气醋酸乙酯。 戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或
己酸，进行鉴别。
三、制备衍生物测熔点
（一）酯的生成
OH
OH
CCH
+
HO
（二）酯的水解
COCl + KOH
COO
m.p.为201℃
丙酸睾丸素
醇制KOH 水解
睾丸素
m.p.为150℃~ 156℃
（三）缩氨基脲的生成
O
O
H H
H2NCONHNH2
CH2OCOCH3 C=O
＋ 2Ag+ + 2OH-
O
醋酸去氧皮质酮
HO O
OH CH
OH C=O
OH
+ Cu2O + H2O
橙红色
HO O
OH CH
OH C=O
OH +2Ag + CH3COOH
黑色
CH2OCOCH3
C=O
O O
OH
+
NN
N N+
OH-
醋酸泼尼松
O
四氮唑盐
OH
CH OH
C=O
OH
结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液
的吸光度。
三、有机溶剂残留量的检查
eg：地塞米松磷酸钠
杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量 甲醇和丙酮。
方法：GC色谱法
结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％
丙酮规定不得过≤5.0%
四、硒的检查
杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激
斑点比较，不得更深。
2、HPLC法（自身对照法）
判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积
≤图A中峰1面积的四分之三
二、游离磷酸盐的检查
杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯
化时残存的过量磷酸盐。
方法：对照品比色法 原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸
钼蓝 740nm
第十章 甾体激素类药物的分析 Analysis of steroid hormones
激素（Hormone，荷尔蒙）
是人体内各种内分泌腺所分泌的一种 生物活性物质。激素作用于特定的称为靶 器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激 素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变， 如甲亢、糖尿病等。
概述
基本结构
（二） 比色法
1、 四氮唑盐比色法
可口服
蛋白同化激素
O O
H H HH O
苯丙酸诺龙
母核有18或19个碳原子
OOCCH3
O Cl
4-氯醋酸睾丸素
（三）孕激素
O CH3
CH3 H
HH O
△4–3–酮基
CH3
C17--甲酮基
H
天然孕激素：黄体酮
母核有21个碳原子
口服被迅速破坏失效， 只能肌注
结构修饰
O CH3
CH3 H
检查方法：（具有一定分离能力） 1、TLC法（自身对照法）
判定方法：规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色
eg：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml 对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60μg/ml 层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出。 判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主
（六）IR法
eg1:炔雌醇
HO
原料药
OH C CH
结构特征： 酚羟基 C17 –OH C17 –乙炔基
νv CH
3300cm-1
3610cm-1
酚羟基
1615cm-1
ν C C
1590cm-1
3505cm-1
醇羟基
1505cm-1
苯环的骨架振动
eg2：黄体酮
CH3 CO
H
HH O
结构特征： △４-3-酮 C17-酮基
N
O NH N
N
3，20-双腙
结论： 成腙反应中
O
CH3
CH3 H
CH3 H
HH O
C3–酮基空间位阻最小， 最易起反应，室温下先生 成单腙。
C20–酮基受C18甲基的 空间位阻影响，反应较 慢，需加热或较长时间 放置，才完成反应。
C11–酮基受C18、C19位甲基甲 基的阻碍，不发生反应。
（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯 肼反应生成腙。
CONHNH2 NO2
CONHNH2 N
CONHNH2 .H2SO4
NO2
（2）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的肟 或缩氨脲。
O
O
O
CH3
CH3 H
CH3 H
+
CONHNH2
HCl
NH N
N
黄色
HH O
N
室温下长
时间加热
NNHCO
测定样品：黄体酮原料、注射液。 定量方法：内标法 内标-1
二、UV-ViS分光光度法
（一）UV分光光度法
1、△４-3-酮 240nm（±）
肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素
2、苯环 280nm（±） 雌激素 缺点：专属性不强
示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查 （1）配制供试液，取10片分别进行测定 （2）测定：240nm （3）计算
结果 斑点的颜色和位置与对 色谱图中，供试品峰的tR与
判断 照品溶液的主斑点相同
对照品峰的tR一致
第三节 特殊杂质检查
一、有关物质的检查
杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以
及试剂和溶剂。
其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，
也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激 素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显 得很重要。
素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，
药物可能引入杂质硒。
方法：药物 氧瓶燃烧
二氨基萘比色法测定 378nm
结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶
液的吸光度（0.005％～0.01％） 。
五、雌酮 六、乙炔基
第四节 含量测定
常用方法
容量法
四氮唑盐比色法
比色法
异烟肼比色法
O
△4–3–酮基
OH
4位引入卤素或19位去 甲基或将A环结构改造 均明显降低雄性作用， 增加蛋白同化作用
天然雄性激素：睾酮 母核有19个碳原子
A环中有△4–3–酮基结构
结构修饰
OOCCH2CH3
OH CH3
O
丙酸睾酮
增加脂溶性，制成油注射剂 可口服、延效
O
甲睾酮
增加位阻，难代谢氧化， 稳定性增强
OOCCH2CH2
HH
O 醋酸泼尼松苯丙酸诺龙
（四）酮肟的生成
OH CH3 C CH
HH
HONH2
HH O
炔诺酮
H2NCONHN
苯丙酸诺龙缩氨脲 m.p.约182℃（分解）
OH CCH
HON
炔诺酮肟 m.p.约195℃（分解）
（五）UV-ViS分光光度法
原 理 200-760nm有特征吸收。
△４-3-酮
+
NN
H2O
+ CH3COOH
NN O
深红色的三苯甲鐕
结论：
反应在碱性条件下（水解）进行。
三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比 色法测含量。
四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药物 中杂质“有关物质”检查的显色剂。
3.甲酮基的呈色反应
适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类
药物。
孕激素
能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反 应呈色。
（1）甲酮基：
黄体酮
亚硝基铁氰化钠
其他甾体
蓝紫色 淡橙色或不显色
☻黄体酮专属性反应。
（2）亚甲基的反应：
硫酸普拉睾酮
乙醇 间二硝基苯
氢氧化钠
紫红色
结论：
与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应。 在碱性条件下进行。
4.酚羟基的呈色反应
CH3 O
CH3
O
口服、长效
HH
O
醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）
CH3
OH CH3 C CH HH
H3C HH
OH C CH
HH O
炔诺酮（睾酮类孕激素）
HH O
炔诺孕酮（睾酮类孕激素）
口服、长效，17-OH作成庚酸 酯，注射一次可维持3个月
（四）雌激素
H CH3
天然的雌性激素：雌二醇
OH
H
母核有18个碳原子
适用：雌激素类药物。
能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮
染料。
OH
OH
COO
+ N=N
苯甲酸雌二醇
SO3- H+
COO N=N
红色
SO3H
5、卤元素的呈色反应 呈蓝紫色
有机氟 有机氯
有机破坏
茜素氟蓝—硝酸亚铈
Fˉ Clˉ
氯原子结合 在母核环上
硝酸—硝酸银
AgCl
6、沉淀反应
（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应
COO
苯甲酸雌二醇
3位羟基酯化， 酯在体内缓慢 水解，延效
人工合成代用品：非甾体化合物
OH
高效、长效
HO
己烯雌二酚
二、特殊官能团与分析方法
△4–3–酮
肾上腺皮质
+
激素
C17–α–醇酮 基
+
C17–β– 羟基
C17–甲酮基
A环为3– OH苯环
雄性与蛋白
+
+
同化激素
雌性激素
+
+
孕激素 鉴别反应
+