发酵法生产谷胱甘肽研究进展_朱玉强

贾学杰等［６］对 ７５ 株酵母菌经初筛、复筛和单 倍体分离， 得到胞内还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量较 高的单倍体酵母菌株 Ｓ１（ａ）， 并进行遗传标记。经 硫酸二乙酯诱变、紫外诱变及两者的复合诱变， ＺｎＣｌ２、乙硫氨酸抗性交替筛选得 ＧＳＨ 含量较高 的单倍体 Ｆ４ （ａ， Ａｒｇ－ ， ＺｎＣｌ２ｒ， Ｅｔｈｒ）， ＧＳＨ 含 量 与 产 量分别比出发单倍体提高了 ７３．５％和 １１８．１％。
饶 志 明 等［１４］考 察 了 培 养 基 组 成 及 培 养 条 件 对 重 组 巴 斯 德 毕 赤 氏 酵 母 （Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｘ—３３ （ｐＧＡＰＺＡ—ｇｓｈ１）合成谷胱甘肽（ＧＳＨ）的影响。优化 后的培养基组成为： 甘油 ３０ ｇ ／ｌ、蛋白胨 ４０ ｇ／ｌ、酵 母膏 ９ ｇ ／ｌ、半胱氨酸 ０．３６ ｇ ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４３ ｇ ／ｌ； 培 养 条件为： 自然 ｐＨ、摇床转速 ２００ ｒ ／ｍｉｎ、装 液 量 为 ３０ ｍｌ ／２５０ ｍｌ、接种量为 １０％。在此优化条件下重 组 酵 母 的 ＧＳＨ 产 量 是 ９８．５ ｍｇ ／ｌ， 为 优 化 前 的 ２．３３ 倍， 生物量最大值达到 １９．６ ｇ ／ｌ。在 ５Ｌ 发酵 罐上进行放大实验， 发酵结束后 ＧＳＨ 产量、重组 菌 的 生 物 量 分 别 为 ９７．９ ｍｇ ／ｌ， １８．７ ｇ ／ｌ 与 摇 瓶 发 酵结果基本吻合。
李 华 钟 等［１１］以 野 生 型 大 肠 杆 菌 Ｅ．ｃｏｌｉＩＩ 为 宿 主细胞， 转化带有编码谷胱甘肽合成酶系的基因 ｇｓｈＩ 和 ｇｓｈＩＩ 的质粒 ｐＧＨ５０１， 获得了一株谷胱甘 肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳， 并且 能够重复使用的重组大肠杆菌 Ｅ．ｃｏｌｉＩＩ１。该菌株 经过甲苯处理后， 能够在胞外积累 ４ ｇ／ｌ 左右的 谷胱甘肽（ＧＳＨ）。在合成反应体系中， 提高 Ｌ 谷氨 酸浓度可促进 ＧＳＨ 合成， 但 Ｌ 半胱氨酸浓度增大 到 ２０ ｍｍｏｌ ／ｌ 后 会 抑 制 ＧＳＨ 的 合 成 。 根 据 ＧＳＨ 合成反应中能量辅因子的变化情况， 提出 Ｅ．ｃｏｌｉＩ－ Ｉ１ 细胞控制的 ＧＳＨ 合成反应机理： 由谷胱甘肽合 成 酶 （ＧＳＨＩＩ） 控 制 的 第 二 步 反 应 的 能 量 供 体 是 ＡＤＰ 而非 ＡＴＰ， 该反应是整个 ＧＳＨ 合成反应的 限速步骤， 高浓度 ＡＤＰ 可能会抑制 ＧＳＨＩＩ 的活 性。在 ＧＳＨ 合成反应体系中添加 １００ ｍｍｏｌ ／ｌ 的 Ｌ 丝氨酸—硼酸钾混合物可以有效地防 止 ＧＳＨ 的 进 一 步 降 解 ， 反 应 ３ ｈ 后 ， ＧＳＨ 产 量 达 到 ２３０ ｍｍｏｌ ／ｌ（约 ７１ｇ ／ｌ）。
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ＡＴＰ相比， 其谷胱甘肽产量提高 １４．５％以上。
２ 培养基、培养条件及培养方式
袁 宏 丽 等［１３］对 实 验 室 保 藏 的 １４ 株 不 同 种 属 的酵母菌株的谷胱甘肽（ＧＳＨ）产量进行了比较， 发 现其中 ｌｏｇ 酵母菌株的 ＧＳＨ 产量最高达 １２７．７８５ ｍｇ ／ｌ。对其营养条件进行了研究， 发现其最佳碳源 为葡萄糖； 硝酸盐会抑制其生长， 而有机氮源对其 生长有利； 考虑到磷和钾对酵母细胞生长及发酵 代谢的作用， 选择 ＫＨ２ＰＯ４ 为培养基中的基本成 分。采用正交试验对培养基的基本成分进行优化， 在 最 佳 培 养 条 件 下 ｌｏｇ 酵 母 的 ＧＳＨ 产 量 有 较 大 幅度的提高， 达到 １４８．５４７ ｍｇ ／ｌ。
童 群 义 等［１２］分 别 考 察 了 面 包 酵 母 、耐 高 温 酵 母合成 ＡＴＰ 的最适条件和重 组 大 肠 杆 菌 合 成 谷 胱甘肽的最适条件， 比较了面包酵母和耐高温酵 母作为 ＡＴＰ 再生菌株对谷胱甘肽合成的影响。结 果表明： 由耐高温酵母构建的 ＡＴＰ 再生谷胱甘肽 合成耦合体系， 与用面包酵母构建的耦合体系相 比， 其谷胱甘肽产量提高 ４３．６％以上； 与直接添加
于春涛等［４］对 酵 母 菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）２．５５８ 进
第 ３７ 卷第 ２ 期 ２００８ 年 ４ 月
发酵科技通讯
行紫外照射、紫外照射＋ＬｉＣｌ 复合处理获得了 １ 株 突变株 Ｆ４００—１， ＧＳＨ 细胞含量 １９．２５ ｍｇ ／ｇ， 比出 发菌株提高了 ５３５．３８％； 发酵液含量达到 １０６．１４ ｍｇ ／ｌ， 比出发菌株提高了 ７４５．０３％。经遗传稳定性 分析， 证明菌株 Ｆ４００—１ 是遗传稳定的。
童群义等［８］筛选到一株具有较高 ＧＳＨ 产量的 酵母菌株 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２１６５， 然后以该菌株为出发 菌， 采用紫外照射、紫外照射＋ＬｉＣｌ 联合处理、亚硝 基 胍（ＭＮＮＧ）等 诱 变 处 理 ， 获 得 一 株 高 产 ＧＳＨ 的 酿酒酵母优良菌株 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＮ—５—８。该菌株 具有稳定的遗传性能， 在经过优化的培养条件下 培 养 ２４ ｈ， 其 ＧＳＨ 产 量 达 到 ３３９．１ ｍｇ ／ｌ， 比 出 发 菌株提高 ２．２ 倍。 １．２ 遗传工程技术
中国科学院微生物研究所酵母分子遗传与育 种研究室［９］使用携带 ＧＳＨ１ 基 因 的 酵 母 一 大 肠 杆 菌穿梭质粒， 使 ＧＳＨ１ 基因在啤酒酵母中高效表 达， 所构建工程菌中谷胱甘肽含量比对照高了 ５０％； 在此研究基础上， 又采用同源重组技术， 将 来 自 啤 酒 酵 母 ＹＳＧ—２６ 的 ＧＳＨ１ 基 因 整 合 至 青 岛啤酒酵母 ＹＳＦ３１ 的乙酰乳酸合成酶基因 ＩＬＶ２
发酵科技通讯
第 ３７ 卷
发酵法生产谷胱甘肽研究进展
朱玉强 （山东师范大学图书馆， 山东济南 ２５００１４）
摘 要： 综述了发酵法生产谷胱甘肽时菌种的选育、培养基、培养条件及培养方式以及分离纯化方 法的研究进展。
关键词： 谷胱甘肽； 发酵工程； 发酵工艺
谷 胱 甘 肽 （Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ， 简 称 ＧＳＨ）是 由 谷 氨 酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的具有多 种重要生理功能的活性三肽（见图 １）， 化学名称为 γ—Ｌ—谷 氨 酰 —Ｌ—半 胱 氨 酰—甘 氨 酸 （γ—Ｌ— Ｇｌｕｔａｍｙｌ—Ｌ—Ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ—Ｇｌｙｃｉｎｅ）。ＧＳＨ 相对分子 质量 ３０７．３３， 熔点 １８９￣１９３℃， 晶体呈无色透明细 长柱状， 等电点为 ５．９３， 溶于水、液氨和二甲基甲 酰胺， 而不溶于醇、醚和丙酮。ＧＳＨ 分子中含有一 特殊肽键 γ—谷氨酰胺键， 其保护肝脏等许多特 殊性质均与此肽键有关； ＧＳＨ 分子中含有一个活 泼的巯基—ＳＨ， 易被氧化脱氢， ２ 分子 ＧＳＨ 脱氢 后转变为 １ 分子氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＧ）。ＧＳＨ 广 泛存在于自然界中， 动物肝脏、酵母和小麦胚芽中 都含有丰富的 ＧＳＨ， 其含量为 １￣１０ ｍｇ ／ｇ， 人和动 物的血液中也含有较多的 ＧＳＨ， 而植物组织中的 ＧＳＨ 含量则较低［１］。
图 １ 谷胱甘肽的化学结构 ＧＳＨ 对 于 维 持 生 物 体 内 适 宜 的 氧 化 还 原 环 境起着至关重要的作用。ＧＳＨ 可保护肝脏， 辅助 治疗肝病、肿瘤、眼 科 疾 病（特 别 是 白 内 障）等 ， 可 增 强 机 体 免 疫 力 、治 疗 糖 尿 病 神 经 损 害 、抗 炎 、抗 —２２—
胡林华等［１５］以 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｇ７９６ —２ 为出发菌株， 通过紫外线照射结合乙硫氨酸 平板筛选， 连续两代诱变筛选分离得到高产突变 株 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＥ—２； 摇瓶试验胞内 谷胱甘肽含量达到 ２．２％， 较出发菌株 Ｇ７９６—２ 提 高 ６２．９％， 传 代 试 验 表 明 其 遗 传 性 能 稳 定 。 对 ＳＥ—２ 的培养条件进行了研究。采用正交化实验 和双碳源实验对培养基进行优化， 结果表明， 最佳 初糖浓度 ６％， 葡萄糖 ／糖蜜＝３．５： １， 半胱氨酸的添 加浓度 ５ ｍｍｏｌ ／ｌ 较为适宜。在优化的培养条件下 培养 ３９ｈ， ＳＥ—２ 谷胱甘肽总量达 １８０ ｍｇ／ｌ 以上， 较 Ｇ７９６—２ 提高 ８１．２％。
１ 菌种选育
普通酵母菌体中 ＧＳＨ 的含量一般不 超 过 细 胞 干 重 的 １．０％ ， 但 有 一 些 酵 母 菌 如 Ｓａｃｃｈａ－ ｒｏｍｙｃｅｓ ｇｌｙｏｘａｌｐｈｉｌｕｓ、热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐ－ ｉｃａｌｉｓ） 和 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｇｃｅｓｃｙｓｔｉｎｏｖｏｌｅｎｓ、 酿 酒 酵 母 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌体内 ＧＳＨ 含量较高， 且能长时间保持合成 ＧＳＨ 的能力。如果以这些酵 母菌株为出发菌株， 采用常规诱变育种选育高产 菌株， 或利用遗传工程技术构建具有 ＧＳＨ 合成酶 活性的基因工程菌， 就有可能选育出更加优良的 菌株， 提高细胞内 ＧＳＨ 的含量。 １．１ 常规诱变育种
尹 吉 泰 等［５］使 用 ＥＭＳ 对 出 发 菌 株（生 产 用 葡 萄酿酒酵母）ＣＩ 进行诱变， 通过蛋氨酸抗性平板， 筛选出了一株产硫化氢低、产谷胱甘肽高的突变 株 Ｍ６； Ｍ６ 的基本发酵性能与出发菌株 ＣＩ 相差不 大， 但 ＧＳＨ 的生成量比 ＣＩ 提高了 ４７．７％， Ｈ２Ｓ 的 生成量比出发菌株 ＣＩ 降低了 ３６．３％。
杨 秀 杰 等 ［５］以 实 验 室 保 存 的 酵 母 菌 为 出 发 菌 株， 通过紫外线、６０Ｃｏγ射线照射及氯化锌平板筛 选高产谷胱甘肽酵母菌菌株。采用四氧嘧啶法测 定 ＧＳＨ 含量， 结果显示摇瓶实验菌体胞内谷胱甘 肽的含量达到 １．３９％， 较出发菌株提高了 ２５０％。 传代试验证明， 其遗传性能稳定。
何俊勇等［７］通过对谷胱甘肽新产 生 菌— ——藤 黄八叠球菌进行紫外诱变处理， 筛选到一株抗乙 硫氨酸和氯化锌的抗性菌株， 该突变株发酵生产 谷胱甘肽的产量比出发菌株提高 ２６８．９％。通过对 碳源、氮源、温度、初始 ｐＨ 等发酵条 件 对 该 菌 株 生物合成谷胱甘肽的影响研究， 表明突变株 ＨＹ７８ 在发酵温度 ３７℃、初始 ｐＨ７．０、摇床转速 １８０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下， 摇瓶发酵 ２６ ｈ， 该高产菌株在发酵液 中合成谷胱甘肽的产量可达 １６０．６２８ ｍｇ ／ｌ。