H_E_染色切片质量影响因素分析

H.E.染色切片质量影响因素分析
杜　辉1,王树迎2,徐淑敏2
(1.泰山医学院组织胚胎教研室,山东泰安271000; 2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018)
H.E.切片染色是生物学和医学领域中组织学和细胞学等学科中最常见的切片染色方法。

染色质量的好坏直接影响到细胞观察的科学性和病理学诊断的准确性。

经过长时间的组织胚胎学H.E.染色切片的制作实践,对影响石蜡切片H.E.染色质量的因素进行了如下分析。

1　取材固定　取材要新鲜、迅速、避免机械损伤、大小适宜、厚薄均匀。

固定要及时、充分。

固定液一般采用10%中性缓冲福尔马林溶液和Bo nin氏液,但是检查糖元、黏液、尿酸结晶类物质最好用无水乙醇固定,固定24～48h,最短不短于30～60min。

固定时间应根据取材大小、性质以及类型有关,视具体情况而定。

固定时间过长或固定液的浓度过高,会使组织变硬,减弱了固定液对组织的渗透能力或造成组织中间部分固定不好。

如浓度太低,在正常固定时间内,蛋白质的沉淀和凝固不够充分,由胶状物变为不溶性的固体,必然固定也不充分,使细胞成分产生的光学差异不够显著,影响媒染效果,导致染色片子发生灰染现象。

若组织块大而厚,可以固定一段时间后切开再固定,也可适当的延长固定时间。

总之,固定是切片制作过程中的重要一环,它直接会影响后面的脱水、浸蜡、切片、染色等步骤,并直接影响观察结果。

2　脱水、透明、浸蜡　组织经过固定冲洗,组织含有较多的水分,只有将水分除去才能进行石蜡包埋,因为石蜡与水不相溶。

将组织中的水分利用脱水剂除去的过程称为脱水。

脱水时间应根据组织大小、性质和类型而安排。

在多种脱水剂中最常用的是乙醇。

它可与水任意混合,脱水力较强,又可硬化组织,但高浓度的乙醇对组织有强烈的收缩和脆化作用。

因此乙醇脱水一般从低浓度过渡到无水乙醇,一般由
通讯作者:王树迎70%→80%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%Ⅰ→100%Ⅱ的浓度梯度脱水。

但胚胎组织如卵巢和柔嫩组织可从30%或50%酒精开始向高浓度进行,柔嫩的组织在95%、100%酒精里脱水时间可适当的延长。

组织块经固定、冲洗、脱水后,因酒精不能与石蜡相溶,必须通过一种媒浸剂取代酒精,这种媒浸剂与石蜡相溶。

媒浸剂取代酒精后常使组织呈现透明状态,因此该过程称为透明。

最常见的透明剂是二甲苯。

二甲苯折光率为1.497,透明力强,但易使组织收缩和变硬变脆。

所以一般在放入二甲苯透明之前,放入二甲苯和酒精的混合液以减少组织的收缩。

放入二甲苯的时间不宜太长一般15～25m in。

在正常透明时间内不透明,可能的原因是脱水不净,组织太厚或组织本身的性质有关。

有的组织如肌肉、肌腱、软骨、皮肤及眼球等因二甲苯透明易于组织变硬变脆而不宜用二甲苯透明。

浸蜡的目的是除去组织中的透明剂(二甲苯)而石蜡浸透到组织中,使软的组织块转变成硬的石蜡块,以便切片。

经观察,组织块厚度大于4mm如山羊卵巢在熔点56～60℃之间蜡内60℃温箱过夜最佳,有利于组织切片连续切片的连带,展片平整和蜡块组织保存时间长。

浸蜡的时间和温度是关键的问题。

浸蜡的温度过高或浸蜡时间太长,会使组织块发生较大的收缩和脆变;如温度低了或时间短了,石蜡将得不到充分的饱和,组织块与石蜡结构不严,将会给制片带来许多的困难。

3　包埋、制片、烤片　包埋是指将组织埋入石蜡、凝固成块。

包埋所用的石蜡一般有两种:熔点为48～50℃蜡和熔点为56～58℃石蜡。

一般冬天用熔点低的蜡,夏天用熔点高的石蜡,或者将节余的蜡混合放在温箱内融化后沉淀去除杂质部分,重新利用。

包埋之前应将包埋框与包埋镊子一起放在温箱中加热。

疗效果,确诊本次发病为猪瘟。

5　控制措施
5.1　对发病猪群的处理　(1)隔离病猪,严格消毒,死猪深埋或焚烧。

(2)用猪瘟疫苗5倍剂量紧急接种。

(3)全群饮水或饲料内投入抗生素、免疫球蛋白或干扰素、电解多维,病猪注射抗生素、免疫球蛋白或干扰素。

也可应用有关中药制剂。

(4)治疗1周后没有康复者或康复后生长缓慢者予以淘汰。

5.2　异地运输仔猪的预防措施　(1)运输前1周,对仔猪进行猪瘟免疫。

(2)运输过程中和到达饲养地给仔猪投服电解多维或补液盐,并保证舍内温度。

(3)如果不明确所引进的仔猪是否进行了猪瘟免疫,在加强营养、防止脱水的情况下,及早(进舍后休息1天)用猪瘟疫苗2倍以上剂量接种。

50经验交流 中国兽医杂志2003年(第39卷)第12期
包埋时速度要快,以防止包埋蜡与组织块的温度相差
太大,蜡与组织块结合不紧密,导致切片困难。

包埋后的蜡块均质半透明状,如在组织的周围出现白色浑浊状,说明浸蜡和包埋不佳,其主要的原因是脱水不彻底,包埋的石蜡温度低包埋时蜡已成凝结状,浸蜡不彻底,石蜡不纯。

切片是整个制作切片过程中关键的一步。

切片之前,先仔细将切片机上的零件和螺丝拧紧,以防切片时发生震动,造成切片厚薄不一,甚至将组织砍掉。

切片时要保持切片刀的锋利否则会造成切片卷曲、皱折不能形成蜡带,如切片刀有缺口,大的会造成切片断裂、破碎、不完整,小的则造成切片染色后明显的刀痕,影响观察。

烤片时37℃烤2h即可。

烤片时间短,会造成染色时切片从载玻片上脱落或脱蜡不净,染的切片会着色浅、不上色或灰染;烤片时间长,会造成对组织的损伤。

血块、皮肤,脑组织要凉干后再烤,否则产生气泡,会影响制片的质量。

4　染色　染色的程度包括脱蜡、浸水、染色、分化、促蓝、脱水、透明等过程。

烤干的切片立即投入二甲苯缸10～15min,为省时间二甲苯可以加热,然后由高浓度向低浓度酒精梯度进水,每级1～2min,不能急速进水,防止组织发生弥散性分裂。

在酒精中稍长时间的停留不会影响切片的染色。

蒸馏水中充分的水洗,水洗不够会使切片发灰、发白,出现云雾状,影响镜下观察。

染色前,最好过滤各染液或定期过滤、染缸加盖等方法避免由于苏木精染液的氧化物或伊红染液的絮状沉淀所致的切片内染污。

染色时间夏季较短,冬季时间适当的延长。

苏木精染色后洗净,时间不宜长,否则染色质变蓝后,盐酸酒精不易分化。

一般盐酸酒精分化5s,冬季适当的延长时间。

分化后可用自来水促蓝,时间一般为30～45m in左右。

也可利用重碳酸钠配制的促蓝液促蓝,时间一般在15m in左右。

此种方法省时而且效果很好。

还可以在50℃温水中浸泡3～5min即可。

当然,染色的时间应根据经验控制,否则会造成切片着色浅、不上色或灰变、云雾状等现象。

完成以上的步骤后,再依次进入酒精95%→95%→100%→100%中进行脱水、透明,最后中性树胶封片,放入37℃的温箱中烤2h左右。

5　染色的结果　H.E.染色成功的切片,胞核呈鲜明的蓝色,细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色、桃红色;红细胞染成橘红色,软骨基膜、钙盐颗粒、肌肉组织染成深红色。

黏液呈灰蓝色;细胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色;蛋白性黏液呈粉色,胶原纤维呈粉红色,核仁呈红色。

刺种鸡痘苗引发蛋鸡
葡萄球菌病
张庆德,米瑞娟,殷凤彬
(齐齐哈尔市兽医卫生防疫站,黑龙江齐齐哈尔161000)
齐齐哈尔市市区某养鸡大户饲养不同日龄的蛋鸡3批,其中30日龄6000只,70日龄5000只,166日龄4500只,饲养状况良好。

2002年11月10日166日龄成鸡群暴发过白喉型鸡痘,为防止疫情扩大对70日龄的育成鸡实行鸡痘紧急刺种,大约3天后即发现有800多只鸡开始出现精神委靡,采食量下降,皮肤发红,腹部、颈部及刺种部皮肤破溃,有葡萄酒样红色渗出物流出。

全群以恩诺沙星拌料、饮水未见效,死亡300多只,急来我站诊断。

1　临床症状　最初发现刺种后个别鸡刺种部位有溃烂迹象,零星死亡未引起注意。

不久大批鸡精神沉郁,食量下降,皮下发红,腹部、颈部及刺种部位多处发生破溃,同时从破溃处流出葡萄酒样红色黏稠液体,死亡率急剧上升。

2　剖检变化　病死鸡皮下,尤以两腿皮下、胸部皮下、翅膀处皮下见血红色黏稠液体。

大腿肌膜出血。

肝脏轻度肿胀,脾肿,肾充血性变化,肠黏膜出血性变化,个别鸡腺胃乳头出血。

3　实验室诊断　(1)无菌取皮下血样渗出物涂片,火焰固定美蓝染色,镜检见单在、少数成对或3～4个相连的球菌。

(2)无菌操作以皮下血样渗出物、心血、肝接种普通琼脂培养基上,置于37℃恒温箱内培养24h,菌落为圆形、边缘整齐、光滑湿润、金黄色或白色不透明。

涂片革兰氏染色,镜检为革兰氏阳性球菌,典型葡萄串状。

(3)抽样与接种的疫苗相同批次鸡痘苗及养殖户稀释疫苗的生理盐水,检菌结果为阳性。

根据症状、剖检变化、实验室检验,结合流行病学调查,认定为葡萄球菌引起的皮炎及败血症。

3　药敏试验　选青霉素、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、复方新诺明、林可霉素、丁胺卡那霉素8种常用药,其中以红霉素、复方新诺明抑菌环> 19mm为高度敏感;林可霉素15m m为中度敏感;其余不敏感。

4　防治　病鸡以高力米先注射液1ml/只肌肉注射,每日2次,连用2～3天;或5%红霉素100mg/L 饮水3～5天。

未发病鸡5%红霉素50m g/L饮水,同时以复方新诺明500mg/kg拌料3～5天。

用威特1∶1000浓度带鸡消毒,早晚各1次,间隔1天消毒1次,连用3次。

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中国兽医杂志2003年(第39卷)第12期 经验交流。