超高效液相色谱-串联质谱法检测螺旋藻保健品中7种微囊藻毒素

超高效液相色谱-串联质谱法检测螺旋藻保健品中7种微囊藻
毒素
李兵;刘伟;范赛;赵榕;吴国华
【摘要】采用固相萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定了螺旋藻保健品中7种微囊藻毒素(MCs).螺旋藻保健品经70％(体积分数)的甲醇超声提取,冷冻离心沉淀杂质后,经HLB柱净化.在WatersACQUITY UPLC(R) BEH C18色谱柱上以乙腈和0.2 mmoL/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱分离,采用电喷雾离子源正离子模式进行多反应离子监测,外标法定量.7种MC在线性范围内线性关系良好(相关系数(r)不小于0.995)；检出限为6.7 ～33.3 μg/kg,定量限为20.0～100.0μg/kg.各分析物在阴性螺旋藻保健品中的加标回收率在87.5％～97.9％之间,相对标准偏差(RSD)在1.6％～6.9％之间.该方法准确可靠,灵敏度高,可用于螺旋藻保健品中MC污染的确证定性、定量检测.%Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( UPLC-MS/ MS) combined with solid phase extraction (SPE) has been developed for the determination of 7 microcystins (MCs) in Spirulina health food products. The sample was extracted by 70% (v/rnv) methanol. The lipid substances were isolated by centrifugation under freezing condition, and then followed by clean-up with a Waters Oasis HLB solid phase extraction cartridge. The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC? BEH C18. column with gradient elution using acetonitrile and 0. 2 mmol/L ammonium acetate. The electrospray ionization ( ESI) source in positive ion mode was used for multiple reaction monitoring (MRM). The external standard method was used for the quantification. The linear ranges for 7
MCs were 20 - 400 p,g/kg, and the correlation coefficients were not less than 0. 995. The limits of detection were 6. 7 - 33. 3 (Jig/kg. The limits of quantification were 20. 0 - 100. 0 jig/kg. The recoveries of the 7 MCs spiked in blank Spirulina samples ranged from 87. 5% to 97. 9% with the relative standard deviations of 1. 6% -6. 9%. The results demonstrated that the method is easy, fast, sensitive, and suitable for the confirmation and quantification of the 7 MCs in Spirulina samples.
【期刊名称】《色谱》
【年(卷),期】2012(030)006
【总页数】6页(P584-589)
【关键词】固相萃取;超高效液相色谱-串联质谱;微囊藻毒素;螺旋藻保健品
【作者】李兵;刘伟;范赛;赵榕;吴国华
【作者单位】北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所,北京100013;北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所,北京100013;北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所,北京100013;北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所,北京100013;北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所,北京100013
【正文语种】中文
【中图分类】O658
螺旋藻是一种含有丰富的蛋白质、矿物质与维生素的蓝藻，国内外曾对螺旋藻进行过系统的安全性毒理学评价，确认它是安全的保健食品［1］。

目前生产螺旋藻主
要通过人工方式在开放的环境下进行养殖。

随着环境污染的进一步加剧，部分养殖螺旋藻的水域受到了产毒蓝藻的侵害，因此使螺旋藻受到了不同程度的微囊藻毒素(microcystins，MCs)污染［1］。

MC是一类单环七肽结构的天然毒素(结构见图1)，具有多器官毒性、遗传毒性和致癌性［2-4］。

最初普遍认为饮水暴露是MC
对人群产生健康危害的主要途径，但是近年来的研究发现，食用受MC污染的螺
旋藻产品带来的危险可能更大［1］。

因此研究和开发针对螺旋藻中MC的分析技术有利于对我国螺旋藻保健食品的安全现状进行调查和评价。

目前较为经典的MC检测方法为蛋白磷酸酶抑制试验。

为了满足快速检测的需要，酶联免疫吸附试验(ELISA)也有较多的应用。

Sassolas等［5］采用蛋白磷酸酶-比色法对MC进行了检测，检出限在0.17 μg/L左右。

Hu等［6］建立了一种新的ELISA方法对鱼与水样中的MC进行检测，该方法的检测范围在0.05～10 μg/L，最低检出限可达到0.024 μg/kg。

但是蛋白磷酸酶抑制试验和ELISA法检测的均
为MC的总量，同时存在着较高的假阳性比率。

近年来随着大型仪器的普及与应用，高效液相色谱法(HPLC)［7，8］与高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)
［9-15］被广泛应用于MC的定性检测，且主要针对环境水样［8，15，16］与
鱼类样品［8，11］。

如Lawrence等［8］采用HPLC测定了蓝藻、鱼、水样品
中MC-RR、MC-YR、MC-LR和MC-LA，在上述样品中的检出限分别为0.03
μg/g、0.03 μg/g、0.02 μg/L。

本文发展了螺旋藻保健品中MC的痕量分析技术，采用70%(体积分数，下同)的甲醇超声提取，冷冻离心沉淀杂质后，经HLB固相
萃取(SPE)柱净化，以超高效液相色谱-串联质谱法(UPLCMS/MS)同时检测了7种MC。

与传统的检测方法相比，本方法的最低检出限可达6.7 μg/kg，并可同时满
足定性、定量的需要，更适用于螺旋藻保健品及水样中MC的检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
ACQUITYTM超高压液相色谱仪和Micromass®-Quattro Premier XE质谱仪(美国 Waters公司)，AllegraTMX-22R型离心机(美国Beckman公司)，氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司);Oasis HLB固相萃取小柱(6 mL，150 mg)和Oasis MCX固相萃取小柱(6 mL，150 mg) (美国Waters公司)。

甲醇、乙腈和乙酸铵均为色谱纯(迪马公司)，甲酸(纯度为99%，Ameisensaeure 公司)，浓氨水(优级纯，北京化工厂);超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm，Millipore
公司超纯水器制备)。

MC标准品:MC-LF、MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LW、MC-LA、MC-LY均购自瑞士Alexis公司，纯度＞95.0%。

精确称取一定量的标准品，以甲醇为溶剂，分别制备质量浓度为100 mg/L的标准储备液，于-20℃冰箱中保存。

需要时各取储备液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释成1 mg/L的混合标准液。

1.2 样品前处理
准确称取螺旋藻保健品1.0 g，样品经10.0 mL 70%甲醇溶液以200 r/min的速
率振荡提取20 min，再以8 000 r/min于4℃离心10 min，将上清液分离，并重复提取一次。

合并两次上清液，用超纯水定容至100 mL，待净化。

Oasis HLB柱经6 mL甲醇、6 mL水活化。

提取液上柱后，采用6 mL纯水、6 mL 20%甲醇水溶液依次淋洗，弃去淋洗液，以5 mL纯甲醇洗脱，收集洗脱液。

将洗脱液以氮气流吹干，用初始流动相复溶后过0.22 μm有机滤膜，滤液供仪器测定。

1.3 分析条件
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。

流动相:A相为乙腈，B相为0.2 mmol/L乙酸铵溶液。

梯度洗脱程序:0～5 min，20%A～90%A;5～6 min，90%A;6～6.5 min，90%A～20%A。

流速:250
μL/min;柱温:40℃;进样量:5 μL。

电喷雾电离正离子模式(ESI+);质谱扫描方式:多反应离子监测(MRM);脱溶剂气:氮
气;碰撞气:氩气;离子源温度:100℃;脱溶剂气温度:450℃;流速:700 L/h;毛细管电压:3.0 kV;锥孔电压: 35 V。

具体质谱参数见表1。

表17 种MC在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的质谱参数Table 1 MS parameters for 7 MCs by UPLC-MS/MS in MRM modeCompound tR/ min Parent ion (m/z) Daughter ion (m/z) Cone voltage/ V Collision energy/ eV MC-YR 2.31 1045.4 106.8 80 70 135 80 65 MC-LR 2.33 995.4 106.9 70 70 135 70 70 MC-LA 2.47 910 135 50 50 357.1 50 30 MC-LY 2.58 1002.52 135 45 50 265.15 45 50 MC-RR 2.59 519.8 126.85 45 45 135 45 30 MC-LW 2.9 1025.4 135 50 60 212.9 50 60 MC-LF 2.97 986.4 135 45 60 213 45 55
2 结果与讨论
2.1 仪器条件的优化
首先利用流动注射的方式进行了MS条件的优化:对各种待测化合物的毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等条件进行了确定，并对不同化合物的碰撞能量进行了优化，得到的各物质的特征离子和碰撞能量如表1所示。

由于MC具有
多肽类结构，其分子结构中存在羟基与氨基等极性基团，极易生成［M+H］+与［M+2H］2+离子［15］，尤其以MC-RR和MC-LW最为明显。

为了确定这两种MC的母离子，本文分别对比了MC-RR及MC-LW的［M+H］+与［M+2H］2+的二级碎片离子的响应值。

结果表明MC-RR的［M+2H］2+离子(m/z 520)
作为母离子可以得到响应更强的二级离子碎片，而MC-LW的［M+H］+离子(m/z 1 025)比［M +2H］2+离子(m/z 514)的二级特征离子响应更高。

因此，最终选择［M+2H］2+离子作为MC-RR母离子，而［M+H］+离子作为MC-LW
母离子。

然而，对于MS检测器而言，不同的液相体系也会影响目标化合物的离子化效率，从而影响目标化合物的检测灵敏度。

为增强目标化合物的离子化效率，通常在流动
相中添加一定量的甲酸［15］。

本实验亦采用甲醇-(0.02%～0.1%)甲酸溶液、乙腈-(0.0%～0.1%)甲酸溶液等为流动相进行一系列预试验。

结果发现乙腈体系的响应值优于甲醇体系。

并且随着甲酸含量的降低，MC-RR的响应明显下降，而MC-LR与MC-YR等6种MC的响应值呈明显的上升趋势。

当甲酸比例降为0时，MC-LF、MCLW、MC-LA、MC-LY的峰形出现严重拖尾。

水相中加入一定量的乙酸铵后峰形恢复正常，但随着水相中乙酸铵浓度升高，MC-RR响应值下降。

因此，最终将流动相确定为乙腈-0.2 mmol/L乙酸铵溶液体系。

2.2 提取溶剂的选择
动物性水产品中MC的提取方法已有报道［6，9，10，16，17］，也有文献报道了蓝藻中MC的提取与制备［15］。

本实验参考文献报道选择了不同浓度的甲醇溶液作提取溶液，优化了螺旋藻保健品中MC的提取方法。

经验证，70%的甲醇溶液具有更好的提取效率，可满足大部分MC的提取要求。

为达到更好的提取效率，在提取过程中一般会采用超声、振荡、长时间静置等物理手段以使目标物自样品中充分析出。

但Smith等［18］的研究也指出，在MC的加标试验中提取效率随着提取时间的延长而呈现明显的下降趋势。

主要原因是MC 与样品中的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽特异性地结合［9］。

由于该结合过程为不可逆反应，且一般认为结合态的MC不会对人体带来危害，因此检测主要针对游离态的MC。

针对这种现象，本实验缩短了螺旋藻样品的提取时间，样品采用200
r/min的速率振荡提取20 min的方式来进行提取。

2.3 SPE柱的对比优化
在生物样品分析中常会遇到基质效应的问题，由于离子抑制作用会降低回收率和精确度，而且增加仪器维护成本和时间，因此样品前处理过程中需采用可靠的净化手段去除杂质，以便后续的检测。

SPE是目前MC分析中应用最为广泛的前处理技术。

由于MC是一种由氨基酸组成的环肽类化合物，所含有的氨基(-NH2)和羧基
(-COOH)具有一定的极性。

因此MC的氨基和羧基基团在溶液中通常会呈现出带
正电荷或负电荷的特性，因此实验最终在净化时选用了Oasis HLB小柱。

同时优
化了HLB小柱的淋洗与洗脱条件，空白螺旋藻加标水平为200 μg/kg，分别用0%、10%、20%、30%、40%、50%、70%和100%甲醇作淋洗液，考察MC的损失情况。

结果表明，淋洗液中甲醇的含量超过30%后，目标物均会受到不同程
度的洗脱，因此淋洗液中甲醇的含量不应超过30%。

实验对洗脱液的用量分别为2、3、4、6、8、10 mL时目标物的回收率进行了比较。

由图2可看出随着洗脱液用量的增加，目标物的回收率亦增加，当洗脱液的
用量为3 mL时，仍有部分目标物未被完全洗脱下来。

为了保证目标物的完全洗脱，最终确定洗脱液的用量为5 mL。

图2 洗脱液体积对MC回收率的影响Fig.2 Effect of the elution volume on the recoveries of MCsSample:blank Spirulina spiked with MC standards at 200 μg/kg.
2.4 精密度与准确度
为消除基质抑制作用，以阴性螺旋藻样品制作空白基质溶液，分别添加相应的标准品制备空白基质匹配的混合标准溶液，其MRM谱图见图3。

分别以各分析物的峰面积(y)和对应的含量(x，μg/kg)进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数(见表2)。

在线性范围内，各分析物均有良好的线性关系(相关系数(r)均不小于0.995)。

检出限采用空白基质溶液加标的方式上机测定，以信噪比(S/N)为3对应的含量作为方法的检出限，以S/N为10对应的含量作为方法的定量限，结果见表2。

图3 空白基质匹配的混合标准溶液(40 μg/L)的MRM谱图Fig.3 Chromatograms of blank matrix-matched standard(40 μg/L)in MRM mode 表2 7种MC的线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，limits of
detection(LODs) and limits of quantification(LOQs)of 7 MCsy:peak area;x:content of the analyte，μg/pound Linear range/ (μg/kg) Linear equation r LOD/ (μg/ kg) LOQ/ (μg/ kg) MC-LY 20-80
y=17.3x+0.992 0.995 6.7 20 MC-LA 100-400 y=31.9x-618.937 0.99533.3 100 MC-LW 40-160 y=59.2x-322.176 0.99613.3 40 MC-LF 40-160 y=60.3x-107.906 0.99813.3 40 MC-YR 100-400 y=102.7x-539.676 0.99633.3 100 MC-LR 100-400 y=205.7x-814.745 0.99733.3 100 MC-RR 40-160 y=236.7x-131.268 0.99513.3 40
在1.0 g空白螺旋藻中添加不同量的混合标准溶液，按实验条件进行处理后测定，计算方法的加标回收率。

空白样品中7种MC的加标回收率在87.5%～97.9%之间，相对标准偏差(RSD)在1.6%～6.9%之间(见表3)。

结果表明所建立的方法准确可靠，重复性好，灵敏度高，且加标样品中目标物的特征子离子丰度比与标准物基本一致，满足质谱方法的确证要求。

表3 空白螺旋藻中7种MC的加标回收率Table 3 Recoveries of 7 MCs spiked in a blank Spirulina sampleCompound Spiked/(μg/kg)Recovery/% RSD/% MC-LY 20 93.5 5.9 30 87.5 5.6 40 90.3 6.9 MC-LA 100 96.0 3.0 150 92.1 6.4 200 91.3 2.8 MC-LW 40 94.3 5.1 60 89.7 4.1 80 90.6 4.7 MC-LF 40 88.6 6.4 60 91.8 4.8 80 92.4 5.6 MC-YR 100 97.9 1.6 150 93.7 5.7 200 96.6 2.7 MC-LR 100 97.7 2.3 150 95.6 5.0 200 93.8 3.6 MC-RR 40 95.2 2.8 60 95.8 3.2 80 96.8 3.2
2.5 实际样品的检测
采用所建立的方法对所采集的11个品牌的24份螺旋藻样品进行了测定，测定结果表明从上述样品中未检出所测定的7种MC。

由于所采集的样品品牌相对单一，样本量较少，因此还不能根据该测定结果来确定该类产品的质量，我们计划扩大采
集样品的种类，开展进一步的筛查。

另外，对实验室培养的铜绿蓝藻培养液进行了测定，测得其中MC-LR的质量浓度为18.2～20.23 μg/L。

3 结语
本文建立了螺旋藻保健品中7种MC的UPLCMS/MS检测方法。

从实际样品的检测结果来看，本方法准确可靠，灵敏度度高，适用于螺旋藻保健品及水样中MC
多残留的确证定量检测，对螺旋藻保健品中MC污染水平的评价具有较好的应用
价值。

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