铁皮石斛提取物对溃疡性结肠炎BALBc小鼠的治疗作用
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关键词：铁皮石斛提取物；ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；葡聚糖硫酸钠；溃疡 性结肠炎；治疗作用；作用机制
溃疡性结 肠 炎 （ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）是 一 种 慢 性复发性溃疡，临床表现出慢性复发性、持续性及难 治性的特点，病因及病理机制尚不十分明确。大量 研究表明，肠腔内各种抗原发生易位，并暴露于黏膜 固有层的免疫系统，引起促炎细胞因子水平升高，抗 炎细胞因子水平下降，导致级联的免疫炎症反应与 ＵＣ有关［１］。目前，针对 ＵＣ的治疗药物主要包括抗 炎药、皮质类固醇、生物制剂、免疫调节剂等，但长期 使用可产生 腹 泻、腹 部 疼 痛 不 适 等 不 良 反 应［２］，且 这些治疗方法并非对所有的 ＵＣ患者均有效［３］。因
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｆｅｂ；３５（２）：２３５～４０
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网络出版时间：２０１９－１－２９９：３５ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０１２５．１５４３．０３６．ｈｔｍｌ
收稿日期：２０１８－０９－２４，修回日期：２０１８－１０－２８ 基金项目：甘肃省自然科学基金资助项目（Ｎｏ１６０６ＲＪＺＡ１３８） 作者简介：赵 佩（１９８４－），女，硕 士，主 管 药 师，研 究 方 向：中 药 抗
炎抗免疫药理学，Ｅｍａｉｌ：３４２１１６１１９＠ｑｑ．ｃｏｍ； 袁继勇（１９７２－），男，副主任药师，研究方向：中药抗炎抗 免疫药理 学，通 讯 作 者，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｃｋｐｅｉｌｏｎｇ１５０３０９＠１６３． ｃｏｍ
此，治疗 ＵＣ的药物开发依旧是研究热点。铁皮石 斛为兰科石 斛 属 草 本 植 物，具 有 滋 阴 清 热、生 津 宜 胃、润肺止咳等功效，现代药理研究表明，铁皮石斛 具有抗炎、增强机体免疫功能、抗氧化、降血糖等广 泛的药理 作 用［４］。 本 研 究 以 铁 皮 石 斛 的 抗 炎 及 调 节免疫作为切入点，通过检测铁皮石斛对 ＵＣ小鼠 炎性反应相关蛋白的影响，初次探讨铁皮石斛对 ＵＣ 小鼠的治疗效应和作用机制，为进一步深入研究传 统中药铁皮石斛的药用价值提供依据。 １ 材料 １．１ 实验动物 健康 ＳＰＦ级 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，♂，体 质量 １８～２０ｇ，由北京维通利华实验动物技术有限 公司提供，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１６００１１。 １．２ 药品与试剂 铁皮石斛购于上海第一制药公 司（批 号：１７０１２２）；５氨 基 水 杨 酸 （５ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，５ＡＳＡ）购于上海爱的发制药有限公司（批号： １６０２０９）；葡 聚 糖 硫 酸 钠 （ｄｅｘｔｒａｎｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ， ＤＳＳ），分子质量为３６０００～５００００，美国 ＭＰＢｉｏｍｅｄ ｉｃａｌｓ公司产品；γ干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ，ＩＮＦγ）、肿瘤 坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒα，ＴＮＦα）试剂盒， 购于美国 Ｒ＆Ｄ公司（批号为 Ｅ２０００１７１１１、Ｅ２７２０ １７１０３）；髓过氧化物酶（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭＰＯ）抗体 购自英国 Ａｂｃａｍ公司（货号：ａｂ３１４１９）。 １．３ 仪器 ＥｙｅｌａＮ１１００旋转蒸发仪（日本 Ｒｉｋａｋｉ ｋａｉ有 限 公 司 ）；Ｌａｂｏｆｕｇｅ４００Ｒ 低 温 离 心 机 （德 国 Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；实时定量 ＰＣＲ仪、电泳仪（美国 Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）；ＵＶ５６００紫外可见分光光度计（上海元 析仪器有限 公 司 ）；ＭＲ９６Ａ酶 标 仪 （深 圳 迈 瑞 生 物 医疗电子股份有限公司）。 ２ 方法 ２．１ 铁皮石斛提取物的制备 根据文献报道［５－６］， 将铁皮石斛在 －８０℃冷冻干燥成粉末，添加 ２０倍 质量体积的甲醇，不断搅拌过夜提取两次。用旋转 蒸发仪蒸发甲醇，并浓缩干燥提取物，最终得铁皮石 斛提取物浸膏粉末。 ２．２ 模型的制备及给药 ＢＡＬＢ／ｃ♂小鼠 ６０只随 机分 为 ６组，分 别 为 正 常 组、ＤＳＳ模 型 组、５ＡＳＡ （１００ｍｇ·ｋｇ－１）对照组、铁皮石斛低、中、高剂量组
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｆｅｂ；ｇ－１），每组 １０只，治疗药物剂 量参考文献报道［５－６］。适应性饲养 １周，观察无异 常表现后再进行实验，实验前 １ｄ，每组小鼠禁食不 禁水 ２４ｈ。参考文献的造模方法，正常组自由饮用 蒸馏水，其余各组自由饮用 ４％ ＤＳＳ溶液，连续 ７ｄ， 诱导 ＵＣ模型，ｄ８开始全部换成蒸馏水。造模 ｄ１ 开始灌胃给药，除正常组与模型组给予蒸馏水外，其 余各组以 ００２ｍＬ·ｇ－１体质量给予相应药物，连续 给药 １０ｄ［７］。 ２．３ 标本采集及处理 末次给药后，小鼠禁食 ２４ｈ 后眼眶取血，以３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １５ｍｉｎ，分离血 清，置 －２０℃冰箱保存。取血完毕后处死小鼠，采 集小鼠结肠组织，称重并测量长度，沿肠系膜缘剪开 肠腔，用生理盐水冲洗肠内容物，剪成 ２段，中性甲 醛溶液内固定，石蜡包埋进行常规病理切片、ＨＥ染 色及免疫组化染色。 ２．４ 指标检测及方法 ２．４．１ 外观指标 造模前后及给药后，观察小鼠的 精神及活动情况，记录体质量。按照 Ｔａｂ１的标准， 每天计算各组小鼠疾病活动指数 （ｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
铁皮石斛提取物对溃疡性结肠炎 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的治疗作用
赵 佩１，刘志龙２，高进贤１，石 磊１，于 静１，葛 斌１，袁继勇１
（甘肃省人民医院 １．药剂科、２．麻醉科，甘肃 兰州 ７３００００）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．０２．０１８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）０２－０２３５－０６ 中国图 书 分 类 号：Ｒ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３２２．４５；Ｒ５７４．６２０．２２； Ｒ５７４．６２０．５３１ 摘要：目的 探讨铁皮石斛提取物对小鼠溃疡性结肠炎（ｕｌ ｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）的治疗作用及机制。方法 ４％葡聚糖硫 酸钠（ＤＳＳ）诱导建立小鼠 ＵＣ模型，观察造模及药物治疗期 间小鼠体征变化，评估疾病活动指数（ＤＡＩ），并对小鼠结肠 组织进行镜下病理评分。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测小鼠结肠组 织中 ＭＰＯ的表达；荧光实时定量 ＰＣＲ法检测结肠中 ＩＦＮγ、 ＴＮＦαｍＲＮＡ的表达；ＥＬＩＳＡ法测定血清中 ＩＦＮγ、ＴＮＦα的 含量。结果 与模型组比较，铁皮石斛提取物不同剂量组小 鼠的结肠长度较长，ＤＡＩ分数、组织学损伤评分 降 低 （Ｐ＜ ００５或 Ｐ＜００１）；血 清 中 ＩＦＮγ、ＴＮＦα含 量 降 低 （Ｐ＜ ００５）；结肠组织中 ＩＦＮγｍＲＮＡ的表达水平和 ＭＰＯ蛋白表 达也明显下降（Ｐ＜００５）。结论 铁皮石斛提取物对 ＵＣ小 鼠有治疗作用，其可能通过抑制 ＩＦＮγ、ＴＮＦα释放，下调促 炎因子 ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＰＯ的表达，阻断炎症的放大效应，达 到治疗效果。
溃疡性结 肠 炎 （ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）是 一 种 慢 性复发性溃疡，临床表现出慢性复发性、持续性及难 治性的特点，病因及病理机制尚不十分明确。大量 研究表明，肠腔内各种抗原发生易位，并暴露于黏膜 固有层的免疫系统，引起促炎细胞因子水平升高，抗 炎细胞因子水平下降，导致级联的免疫炎症反应与 ＵＣ有关［１］。目前，针对 ＵＣ的治疗药物主要包括抗 炎药、皮质类固醇、生物制剂、免疫调节剂等，但长期 使用可产生 腹 泻、腹 部 疼 痛 不 适 等 不 良 反 应［２］，且 这些治疗方法并非对所有的 ＵＣ患者均有效［３］。因
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｆｅｂ；３５（２）：２３５～４０
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网络出版时间：２０１９－１－２９９：３５ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０１２５．１５４３．０３６．ｈｔｍｌ
收稿日期：２０１８－０９－２４，修回日期：２０１８－１０－２８ 基金项目：甘肃省自然科学基金资助项目（Ｎｏ１６０６ＲＪＺＡ１３８） 作者简介：赵 佩（１９８４－），女，硕 士，主 管 药 师，研 究 方 向：中 药 抗
炎抗免疫药理学，Ｅｍａｉｌ：３４２１１６１１９＠ｑｑ．ｃｏｍ； 袁继勇（１９７２－），男，副主任药师，研究方向：中药抗炎抗 免疫药理 学，通 讯 作 者，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｃｋｐｅｉｌｏｎｇ１５０３０９＠１６３． ｃｏｍ
此，治疗 ＵＣ的药物开发依旧是研究热点。铁皮石 斛为兰科石 斛 属 草 本 植 物，具 有 滋 阴 清 热、生 津 宜 胃、润肺止咳等功效，现代药理研究表明，铁皮石斛 具有抗炎、增强机体免疫功能、抗氧化、降血糖等广 泛的药理 作 用［４］。 本 研 究 以 铁 皮 石 斛 的 抗 炎 及 调 节免疫作为切入点，通过检测铁皮石斛对 ＵＣ小鼠 炎性反应相关蛋白的影响，初次探讨铁皮石斛对 ＵＣ 小鼠的治疗效应和作用机制，为进一步深入研究传 统中药铁皮石斛的药用价值提供依据。 １ 材料 １．１ 实验动物 健康 ＳＰＦ级 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，♂，体 质量 １８～２０ｇ，由北京维通利华实验动物技术有限 公司提供，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１６００１１。 １．２ 药品与试剂 铁皮石斛购于上海第一制药公 司（批 号：１７０１２２）；５氨 基 水 杨 酸 （５ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，５ＡＳＡ）购于上海爱的发制药有限公司（批号： １６０２０９）；葡 聚 糖 硫 酸 钠 （ｄｅｘｔｒａｎｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ， ＤＳＳ），分子质量为３６０００～５００００，美国 ＭＰＢｉｏｍｅｄ ｉｃａｌｓ公司产品；γ干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ，ＩＮＦγ）、肿瘤 坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒα，ＴＮＦα）试剂盒， 购于美国 Ｒ＆Ｄ公司（批号为 Ｅ２０００１７１１１、Ｅ２７２０ １７１０３）；髓过氧化物酶（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭＰＯ）抗体 购自英国 Ａｂｃａｍ公司（货号：ａｂ３１４１９）。 １．３ 仪器 ＥｙｅｌａＮ１１００旋转蒸发仪（日本 Ｒｉｋａｋｉ ｋａｉ有 限 公 司 ）；Ｌａｂｏｆｕｇｅ４００Ｒ 低 温 离 心 机 （德 国 Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；实时定量 ＰＣＲ仪、电泳仪（美国 Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）；ＵＶ５６００紫外可见分光光度计（上海元 析仪器有限 公 司 ）；ＭＲ９６Ａ酶 标 仪 （深 圳 迈 瑞 生 物 医疗电子股份有限公司）。 ２ 方法 ２．１ 铁皮石斛提取物的制备 根据文献报道［５－６］， 将铁皮石斛在 －８０℃冷冻干燥成粉末，添加 ２０倍 质量体积的甲醇，不断搅拌过夜提取两次。用旋转 蒸发仪蒸发甲醇，并浓缩干燥提取物，最终得铁皮石 斛提取物浸膏粉末。 ２．２ 模型的制备及给药 ＢＡＬＢ／ｃ♂小鼠 ６０只随 机分 为 ６组，分 别 为 正 常 组、ＤＳＳ模 型 组、５ＡＳＡ （１００ｍｇ·ｋｇ－１）对照组、铁皮石斛低、中、高剂量组
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｆｅｂ；ｇ－１），每组 １０只，治疗药物剂 量参考文献报道［５－６］。适应性饲养 １周，观察无异 常表现后再进行实验，实验前 １ｄ，每组小鼠禁食不 禁水 ２４ｈ。参考文献的造模方法，正常组自由饮用 蒸馏水，其余各组自由饮用 ４％ ＤＳＳ溶液，连续 ７ｄ， 诱导 ＵＣ模型，ｄ８开始全部换成蒸馏水。造模 ｄ１ 开始灌胃给药，除正常组与模型组给予蒸馏水外，其 余各组以 ００２ｍＬ·ｇ－１体质量给予相应药物，连续 给药 １０ｄ［７］。 ２．３ 标本采集及处理 末次给药后，小鼠禁食 ２４ｈ 后眼眶取血，以３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １５ｍｉｎ，分离血 清，置 －２０℃冰箱保存。取血完毕后处死小鼠，采 集小鼠结肠组织，称重并测量长度，沿肠系膜缘剪开 肠腔，用生理盐水冲洗肠内容物，剪成 ２段，中性甲 醛溶液内固定，石蜡包埋进行常规病理切片、ＨＥ染 色及免疫组化染色。 ２．４ 指标检测及方法 ２．４．１ 外观指标 造模前后及给药后，观察小鼠的 精神及活动情况，记录体质量。按照 Ｔａｂ１的标准， 每天计算各组小鼠疾病活动指数 （ｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
铁皮石斛提取物对溃疡性结肠炎 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的治疗作用
赵 佩１，刘志龙２，高进贤１，石 磊１，于 静１，葛 斌１，袁继勇１
（甘肃省人民医院 １．药剂科、２．麻醉科，甘肃 兰州 ７３００００）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．０２．０１８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）０２－０２３５－０６ 中国图 书 分 类 号：Ｒ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３２２．４５；Ｒ５７４．６２０．２２； Ｒ５７４．６２０．５３１ 摘要：目的 探讨铁皮石斛提取物对小鼠溃疡性结肠炎（ｕｌ ｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）的治疗作用及机制。方法 ４％葡聚糖硫 酸钠（ＤＳＳ）诱导建立小鼠 ＵＣ模型，观察造模及药物治疗期 间小鼠体征变化，评估疾病活动指数（ＤＡＩ），并对小鼠结肠 组织进行镜下病理评分。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测小鼠结肠组 织中 ＭＰＯ的表达；荧光实时定量 ＰＣＲ法检测结肠中 ＩＦＮγ、 ＴＮＦαｍＲＮＡ的表达；ＥＬＩＳＡ法测定血清中 ＩＦＮγ、ＴＮＦα的 含量。结果 与模型组比较，铁皮石斛提取物不同剂量组小 鼠的结肠长度较长，ＤＡＩ分数、组织学损伤评分 降 低 （Ｐ＜ ００５或 Ｐ＜００１）；血 清 中 ＩＦＮγ、ＴＮＦα含 量 降 低 （Ｐ＜ ００５）；结肠组织中 ＩＦＮγｍＲＮＡ的表达水平和 ＭＰＯ蛋白表 达也明显下降（Ｐ＜００５）。结论 铁皮石斛提取物对 ＵＣ小 鼠有治疗作用，其可能通过抑制 ＩＦＮγ、ＴＮＦα释放，下调促 炎因子 ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＰＯ的表达，阻断炎症的放大效应，达 到治疗效果。