【药学课件】生物技术制药(4)
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第四章 抗体制药
生物技术制药——4
.
第一节 概述
• 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒 素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。
• 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为 白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性 主要存在于γ球蛋白组分。
.
第一节 概述
• 抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原 特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
.
2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免 疫原性极弱且引起免疫抑制时。
• 抗原量少（＜10μg）、免疫期短（4-5d）、 干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。
• 4-8W BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加 Ag达0.5-5μg/ml，培养4-5d（370C、 5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。
.
淋巴细胞 （致敏动物脾细胞）
3、亲和力测定 4、特异性、纯度、识别抗原的相对分子量等
• 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源 稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应 用提供了全新的手段，还促进了基础和临床 医学的发展。
.பைடு நூலகம்
单克隆抗体的应用：
• 单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要 用于疾病的诊断和治疗。
• 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原， 辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆 抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
p3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 8-Ag
——
SP2/0-Ag14 SP2/0 BALB/c 8-Ag
——
Fast-Zero FO BLAB/c 8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 8-Ag
—— κ链
YB2-3.0-Ag20 YB2 (LouAO)F1 8-Ag
——
• 针对一个抗原决定簇、单一B细胞克隆产生、 结构和特异性完全相同、高纯度。
.
抗原 小鼠/大鼠
脾脏
淋巴细胞 骨髓瘤细胞
多 克
B淋巴细胞
隆
单克隆
.
第二节 单克隆抗体——抗原与动物免疫
1、制备抗原→动物免疫 • 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用
于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 • 有的抗原可以用化学合成：地高辛
DNA合成) T (胸腺嘧啶)
RPMI1640培养液
成分
含量
RPMI1640粉
10.4g
HEPES
2.4g
L-谷氨酰胺
0.3g
青霉素、链霉素 各10万U
水
1000ml
pH=7.4，过滤、除菌
.
第二节 单克隆抗体
——筛选阳性克隆与克隆化
1、筛选 • 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 2、克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获
骨髓瘤细胞 （腹水癌型浆细胞）
融合处理
选择融合细胞 培养杂交瘤细胞
培养液含单克隆抗体
.
杂交瘤细胞克隆化
BALB/c小鼠
腹水中含单克隆抗体
第二节 单克隆抗体 ——细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养
PEG：40%-50% 4000，2min
DMSO
②
脾细胞 1×108 ①
骨髓瘤细胞 2×107～3×107
③
+培养液稀释PEG
融合率高
自身不分泌抗体
杂交瘤细胞分泌抗 体强而稳定
.
脾——脾
×
脾——瘤
瘤——瘤
×
瘤细胞
× HAT/7d
小鼠腹腔 巨噬细胞
脾细胞
胸腺细胞
HT/714d
RPMI164 0
抗体阳性检测 （8-9天）
.
HAT培养液
成分 浓 度 H 1.0×10-4mol/L A 4.0×10-7mol/L T 1.6×10-5mol/L H（次黄嘌呤） A (氨甲喋呤，阻断
.
• 单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗 体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有 抑制作用。
• 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行 定向治疗。
.
免疫导向疗法的障碍与改造
• 鼠源性、分子量大 • 降低免疫源性、降低分子量
.
第二节 单克隆抗体
• 单克隆抗体：将抗体产生细胞（B淋巴细胞） 与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合， 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为 纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。
.
2、抗原的制备与纯化 • 多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、
克隆化。 3、免疫动物品系与骨髓瘤细胞品系
• 骨髓瘤细胞来源：BALB/c小鼠、Lou大鼠
.
骨髓瘤细胞系
全 名 简称 来源 耐受 表达自身Ig分子
p3-X63-Ag8 X63 BALB/c 8-Ag Ig-r1.κ MOPC11-X45-6TG X45 BALB/c 6-TG Ig-r2b p3-NS1-Ag4.1 NS-1 BALB/c 8-Ag κ（非分泌型）
• 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激 后，B淋巴细胞被活化增殖、分化为浆 细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 即B细胞→浆细胞→球蛋白
.
（1）抗体与免疫球蛋白
• 20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌 变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现 同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋 白（immunoglobulin，Ig）。
得细胞集团的整个培养过程。 • 有限稀释法：HT培养液/饲养细胞 • 软琼脂法：0.5%琼脂糖凝胶/易成功
.
第二节 单克隆抗体 ——杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
1、染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分 泌抗体的能力。数目多、集中（稳定高效 价）
2、McAb的Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不 同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴 定。
• 所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学 功能的概念。
.
（2）多克隆抗体与单克隆抗体
• 多克隆抗体（polyclonal antiboty, PcAb）： 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物 质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混 合物，故称多克隆抗体。
.
• 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonal antibody McAb）。
.
免疫方法：体内、体外
1、体内免疫法：适合免疫性强、抗原量较多、8-12 周 龄雌鼠。
• 颗粒性抗原：S.C 107个细胞初次免疫，1-3W免疫 1-2次；
• 可溶性抗原：10-100μg（Ag）+等量福氏完全佐剂 （S.C），2-4W/1-2次（不加佐剂）
• 采集脾细胞前3d iv最后一次抗原（刺激B细胞分裂） • 脾内免疫法：Ag 0.1-0.2ml，105/10μg（追加免疫）
生物技术制药——4
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第一节 概述
• 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒 素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。
• 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为 白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性 主要存在于γ球蛋白组分。
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第一节 概述
• 抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原 特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
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2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免 疫原性极弱且引起免疫抑制时。
• 抗原量少（＜10μg）、免疫期短（4-5d）、 干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。
• 4-8W BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加 Ag达0.5-5μg/ml，培养4-5d（370C、 5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。
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淋巴细胞 （致敏动物脾细胞）
3、亲和力测定 4、特异性、纯度、识别抗原的相对分子量等
• 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源 稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应 用提供了全新的手段，还促进了基础和临床 医学的发展。
.பைடு நூலகம்
单克隆抗体的应用：
• 单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要 用于疾病的诊断和治疗。
• 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原， 辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆 抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
p3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 8-Ag
——
SP2/0-Ag14 SP2/0 BALB/c 8-Ag
——
Fast-Zero FO BLAB/c 8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 8-Ag
—— κ链
YB2-3.0-Ag20 YB2 (LouAO)F1 8-Ag
——
• 针对一个抗原决定簇、单一B细胞克隆产生、 结构和特异性完全相同、高纯度。
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抗原 小鼠/大鼠
脾脏
淋巴细胞 骨髓瘤细胞
多 克
B淋巴细胞
隆
单克隆
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第二节 单克隆抗体——抗原与动物免疫
1、制备抗原→动物免疫 • 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用
于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 • 有的抗原可以用化学合成：地高辛
DNA合成) T (胸腺嘧啶)
RPMI1640培养液
成分
含量
RPMI1640粉
10.4g
HEPES
2.4g
L-谷氨酰胺
0.3g
青霉素、链霉素 各10万U
水
1000ml
pH=7.4，过滤、除菌
.
第二节 单克隆抗体
——筛选阳性克隆与克隆化
1、筛选 • 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 2、克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获
骨髓瘤细胞 （腹水癌型浆细胞）
融合处理
选择融合细胞 培养杂交瘤细胞
培养液含单克隆抗体
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杂交瘤细胞克隆化
BALB/c小鼠
腹水中含单克隆抗体
第二节 单克隆抗体 ——细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养
PEG：40%-50% 4000，2min
DMSO
②
脾细胞 1×108 ①
骨髓瘤细胞 2×107～3×107
③
+培养液稀释PEG
融合率高
自身不分泌抗体
杂交瘤细胞分泌抗 体强而稳定
.
脾——脾
×
脾——瘤
瘤——瘤
×
瘤细胞
× HAT/7d
小鼠腹腔 巨噬细胞
脾细胞
胸腺细胞
HT/714d
RPMI164 0
抗体阳性检测 （8-9天）
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HAT培养液
成分 浓 度 H 1.0×10-4mol/L A 4.0×10-7mol/L T 1.6×10-5mol/L H（次黄嘌呤） A (氨甲喋呤，阻断
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• 单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗 体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有 抑制作用。
• 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行 定向治疗。
.
免疫导向疗法的障碍与改造
• 鼠源性、分子量大 • 降低免疫源性、降低分子量
.
第二节 单克隆抗体
• 单克隆抗体：将抗体产生细胞（B淋巴细胞） 与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合， 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为 纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。
.
2、抗原的制备与纯化 • 多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、
克隆化。 3、免疫动物品系与骨髓瘤细胞品系
• 骨髓瘤细胞来源：BALB/c小鼠、Lou大鼠
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骨髓瘤细胞系
全 名 简称 来源 耐受 表达自身Ig分子
p3-X63-Ag8 X63 BALB/c 8-Ag Ig-r1.κ MOPC11-X45-6TG X45 BALB/c 6-TG Ig-r2b p3-NS1-Ag4.1 NS-1 BALB/c 8-Ag κ（非分泌型）
• 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激 后，B淋巴细胞被活化增殖、分化为浆 细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 即B细胞→浆细胞→球蛋白
.
（1）抗体与免疫球蛋白
• 20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌 变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现 同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋 白（immunoglobulin，Ig）。
得细胞集团的整个培养过程。 • 有限稀释法：HT培养液/饲养细胞 • 软琼脂法：0.5%琼脂糖凝胶/易成功
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第二节 单克隆抗体 ——杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
1、染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分 泌抗体的能力。数目多、集中（稳定高效 价）
2、McAb的Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不 同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴 定。
• 所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学 功能的概念。
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（2）多克隆抗体与单克隆抗体
• 多克隆抗体（polyclonal antiboty, PcAb）： 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物 质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混 合物，故称多克隆抗体。
.
• 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonal antibody McAb）。
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免疫方法：体内、体外
1、体内免疫法：适合免疫性强、抗原量较多、8-12 周 龄雌鼠。
• 颗粒性抗原：S.C 107个细胞初次免疫，1-3W免疫 1-2次；
• 可溶性抗原：10-100μg（Ag）+等量福氏完全佐剂 （S.C），2-4W/1-2次（不加佐剂）
• 采集脾细胞前3d iv最后一次抗原（刺激B细胞分裂） • 脾内免疫法：Ag 0.1-0.2ml，105/10μg（追加免疫）