抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达-最新年精选文档

抗除草剂Bar 基因的优化及PAT 蛋白的表达
DOI ：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.10.058
Bar 基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化
细胞产生的假阳性个体少等优
点， 被广泛应用于转基因玉米
( Zea
maysL.)、大豆(Glycine maX)、油菜(Brassica campestris L. )、水稻( Oryza sativa L. )、小麦( Triticum aestivum Linn. ) 和大麦( Hordeumvulgare L. )植物基因工程研究中
基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其能够使草丁膦的有效 膦丝菌素(PPT 失活，从而解除除草剂的毒性。

Bar 基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因， 也是遗传转化 中的标记基因［4］。

目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数
依据Bar 基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。

而 由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知， 表型筛 选易受环境等因素影响，导致了鉴定准确性不高。

转基因植物标 记基因的检测方法主要有表型鉴定、 PCR 鉴定、ELISA 和Western 印迹等方法 ［5］ o ELISA 分析法特异性高，获得结果快，仪器操 作简单，同时可降低检测成本［6-8］。

建立Bar 基因原核表达体 系，表达和纯化PAT 蛋白质可为转基因转化外源蛋白质提供参 考，本研究通过密码子优化和全基因合成， 获得了适合原核表达 的Bar 基因片段，并分离纯化得到的高纯度 PAT 蛋白质，可作为 抗原为制备多抗和单抗打下基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体 pET28a （+）、大肠杆菌
[1-3] o Bar 成分
(Escherichia coli ) BL21 (DE3和大肠杆菌 DH5况由吉林省农业科学院生物技术研究所转基因安全评价室保存。

1.1.2酶及试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs引物Marker购自宝生物工程（大连） XX公司；氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG十二烷基磺酸钠（SDS和3 -巯基乙醇购自P romega 公司；Ni-NTA His Bi nd Resin 、层析柱购自北京鼎国昌盛生物技
术有限责任公司。

1.2 方法
1.2.1克隆基因片段以合成引物PCF扩增Bar基因全长，然后
用BamH I和Hi nd m内切酶分别酶切 p ET-28a载体和扩增片段，将扩增片段连接PET-28a载体，连接产物转化至DH5况感受态细胞。

利用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为PET-Bar。

提取质粒pET-Bar并转化到BL21 （DE3感受态细胞。

挑取含PET-Bar质
粒的单克隆菌落，接种于 100 mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37 C振荡培养过夜。

次日用LB（Amp+ 稀释至1 000 mL 37 C培养至
OD600nm为1.0左右，力n IPTG至终浓度为1 mol/L。

37 C继续培养6 h后4 C、5 000 r/min 离心10 min，收集沉淀并用PBS洗涤。

1.2.2密码子的优化利用 SignalP 3.0 Server 软件预测
Bar 基因序列有无信号肽及其位置；利用 TargetP 1.1Server 软
件检测此信号肽的功能。

将链霉菌中Bar 基因密码子与大肠杆菌
偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将 Bar 基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码子。

1.2.3表达载体的构建将含有目的基因的片段切下并用胶
回收试剂盒回收，再与同样酶切处理的载体P ET28a连接，并转化大肠杆菌DH5x，碱解法提取质粒，根据酶切鉴定结果，筛选含有 Bar 基因的重组质粒命名为 pET28a-Bar 。

摇菌过夜培养，取1 mL菌液送北京鼎国昌盛生物技术公司测序以确定基因序列。

1.2.4外源基因的诱导表达将含有 pET28a-Bar 表达载体的
BL21 (DE3菌株于37 C活化过夜后，按4： 100稀释到20 mL含有60 mg/mL卡那霉素的LB培养基中。

振荡培养至OD600nm 为0.6〜1.0时，加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，再继续培养 3 h 后 12 000 r/min 离心 5 min 后收集菌体，用 0.025 mol/L
Tris-HCl (PH 8.0 )重悬菌体， 12 000 r/min 离心 2 min 收集菌体，置于-20 C备用。

1.2.5诱导表达条件的优化振荡培养至OD600 nm为0.6 时，加入IPTG后2 h、5 h、过夜诱导，分别取出1 mL菌液，
12 000 r/min 离心1 min收集菌体，菌体置于-20 C备用。

以
SDS-PAGE分析不同的表达时间对蛋白质诱导表达量的影响。

菌液振荡培养至OD600 nm为0.6时，加入IPTG至终浓度分别为1 mmol/L，分别在37 C继续诱导5 h以上，其中在每隔1 h均取
出 1 mL 菌液， 12 000 r/min 离心 1 min 收集菌体，用 SDS-PAGE 电泳分析最佳诱导表达时间。

126目的蛋白质的纯化取诱导表达3 h后的菌液，4 C、
6 000 r/min 离心 20 min 收集菌体，将菌体破碎后分别收集可溶性和包涵体表达的PAT蛋白质，利用镍离子亲和层析柱纯化，
可溶性表达的PAT蛋白质在非变性条件下纯化，包涵体形式的
PAT蛋白质在变性条件下纯化。

2 结果与分析
2.1 密码子的优化利用 SignalP
3.0 Server 软件预测 Bar 基因
序列有无信号
肽及其位置；利用 TargetP 1.1Server 软件检测此信号肽的功能。

将链霉菌中 Bar 基因密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性将 Bar 基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码子（图1）。

2.2 优化序列合成序列确定后在基因的5’端引入BamHI酶切位
点，3’端弓
入Hind m酶切位点，并加入保护碱基进行全基因合成。

扩增Bar 基因全长的引物： BarF：5’ -CGCGGATCCATGTCTC3’CG；- BarR：5’ -CCCAA
GCTTGATTTCGGTAAC-分别用前1〜14条和13〜26条弓
物进行PCF扩增，把两次扩增后的产物各取 1 U L做模板，用
BarF和BarR引物进行基因全长扩增，PCFT增产物见图3。

测序结果表明，优化前后核苷酸序列同源性为 79.89%，氨基酸（183
个）同源性为 100%。

2.3 pET28a-Bar 表达载体的构建
将Bar基因片段和pET28a载体以BamH和Hind m双酶切后，T4 DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5x 中，然后将阳性质粒 pET28a-Bar 转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中，表达质粒 pET28a-Bar 酶切鉴定结果见图 4。

2.4 Bar 基因的原核表达诱导
挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有100 mg/mL氨衣青霉素的LB液体培养基中，37 C振荡培养过夜，然后1 : 100 接种于含有氨苄青霉素 LB液体培养基中，OD60Chm为0.4〜0.6
时加入IPTG振荡培养5 h诱导表达，将蛋白质进行 SDS-PAG电泳。

结果（图 5）表明，该重组表达载体表达外源蛋白质的最佳
诱导时间为 3 h ，重组蛋白质存在于超声破碎的沉淀中，所以表
达蛋白质为包涵体，为非可溶性的蛋白质。

2.5 PAT 蛋白质的纯化
以包涵体形式PAT蛋白分别经镍离子亲和层析纯化（图6）, 纯化方法。