课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数

D
4.(09上海)（9分）氯苯化合物是重要的有机化工原料， 原因不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验 方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌， 培养基配方如表1
（1）配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成 琼脂 分外，还应添加1%的_______。 先调PH，后灭菌 （2）培养基配制时，灭菌与调PH的先后顺序是____。 （3）从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于 通用 选择 _____培养基和______培养基。在Ⅱ号培养基中，为 硝酸铵 SP1菌提供氮源的成分是_______。 （4）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个 芽孢 圆形的休眠体，这种休眠体被称为_________。 （5）将SP1菌接种在含 不同浓度氯苯的Ⅲ号培 养液中培养，得到生长曲 线（如图2）。从图2可知 20mg/L氯苯 SP1菌在____________培 养条件下最早停止生长， 氯苯最早耗尽 其原因是____________。
③为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴 别培养基中加入 刚果红 染液，将筛选获得的菌液稀 释后用 涂布平板法法接种到鉴别培养基上，然后挑选产 生 透明圈 的菌落作为菌种进行扩大培养。 ④纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢?可设 计实验进行检测，请写出实验思路： 向定量纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素， 定时测定葡萄糖产量的变化 (2)乙醇是酵母菌的发酵产物。发酵时酵母菌直接利用的 物质是 葡萄糖(或纤维素酶解产物) 。 (4)发酵时乙醇浓度升高会对酵母菌产生毒性，从而影响 进一步的发酵。科学家利用基因工程方法创造出一种对 乙醇浓度有高耐受力的酵母菌新菌种，该过程需采用 PCR技术扩增目的基因。与体内DNA复制相比，PCR反 应体系除需加入两种引物外，还需加入_____________ 耐热的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) ________________________
四、课堂总结、点评
分离筛选微生 人为条件 物的原理 微生物计数 方法与原理 对照设置与 重复设置 实验设计 实验方案 有利于目的菌株 生长抑制或阻止 其他微生物生长
土壤 中尿 素分 解菌 的分 离与 计数
稀释涂布平 板法显微镜 直接计数法
实验操作
结果与分析
五、课余作业
活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量 的测、食品卫生和水源污染度的检测。 选做： 1、空气中微生物总数的检测 2、水中细菌总数的检测 3、牛奶中 细菌的分离与计数 4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与 技术
能分解尿素的细菌的筛选
阅读教材22页第一大段相关内容，并思考回答下列
问题：
1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和 氮源的分别是是什么物质？ 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？ 如果有，又是如何进行筛选的？ 有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分
(09湛江一模) 生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。 我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为： 纤维素酶解→酵母发酵→蒸馏 →成品。 (1)纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化 生产的关键因素。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培 养液中提取。某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌 的实验流程：土壤取样--选择培养--梯度稀释--鉴别培养。 ①最好选择怎样的环境采集土样? 选择纤维素丰富的土壤环境 ②以下是一种培养基配方：纤维素粉5g、NaN03 1g、 Na2HP04· 20 1.2g、KH2P04O.9g、 MgS04· 20 O.5g、 7H 7H KCl 0.5g、酵母膏0.5g、水解酵素0.5g(蒸馏水定容到 1.0mL)。 该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原 理是 培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌 。 生长，同时抑制其他微生物生长
B
A
3.（09安徽卷）下列是关于“检测土壤中细 菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是 A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高 温、高压灭菌后倒平板 B.取104、105 、106倍的土壤稀释液和无菌 水各0.1ml，分别涂布于各组平板上 C.将实验组和对照组平板倒置，370C恒温培 养24-48小时 D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以 上的实验组平板进行计数
1.原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当 土壤中 的 细菌将尿素分解成氨之后，才能 被植物利用。尿素细菌能合成脲酶，在脲酶 的作用下尿素被分解成氨。 CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
（2）实验设计的内容包括实验方案、材料用 具、实施步骤和时间安排等。 （3）实验流程：
土壤取样
样品系列稀释
涂布平板与培养 菌落计数 观察并记录结果
1、土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中 性土壤中，约70％～80％为细菌。 2、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原 因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保 证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。 细菌稀释度为104、105、106， 放线菌稀释度为103、104、105， 真菌稀释度为102、103、104。
（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，
转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比
稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别 吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序 涂布平板。 将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时 间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选 择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养
基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。
（5）细菌的计数
选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度
下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并 根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
三、结果分析与评价
（1） 对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生 物化学 的方法。 (2) 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升高 。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断 该化学反应是否发生。 (3) 在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示 剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红 ， 说明该细菌能够 分解尿素 。 [思考10]测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体 积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养 基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑 色，通过记述得出水样 中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 三 个水 样。
b、对照原则：判断培养基中是否有杂菌污染，将未接 种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用，对照培养基接 种后培养观察菌落数目。 计算公式：每克样品中的菌株数=（C/V）ⅹM A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：一 是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究 竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 实验方案有两种：一种方案是可以由其他同学用与A同 学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证 明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或 培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培 养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以 证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实 验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
1.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其 结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低 2.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( ) A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、 尿素、琼脂、水 B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、 琼脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、 琼脂、水 D. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、 蛋白胨、琼脂、水
示意图”）。稀释倍数为 103 ～107。每个稀释度均用3个 选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要15个选择 培养基，5个牛高温消毒
将准备好的培养基和8支试管、一支移液管（用纸包 好）放到高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理。
（4）微生物的培养与观察
将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中
（一）筛选菌株 自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的 环境中去寻找。(如耐高温的TaqDNA聚合酶) 实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件 （包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其 他微生物生长。 选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微 生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 的培养基。目的是从众多微生物中分离所需要的 微生物。
3、 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌一般在30～37℃培养1～2d， 放线菌一般在25～28℃培养5～7d， 霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 4、 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因 培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增 值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能 形成肉眼可观察到的菌落。 5、菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜 色 等方面。
你认为在该实验中至少应取三结果分析与评价四课堂总结点评实验方案分离筛选微生物的原理有利于目的菌株生长抑制或阻止其他微生物生长人为条件微生物计数方法与原理稀释涂布平板法显微镜直接计数法对照设置与重复设置实验设计实验操作结果与分析土壤活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测食品卫生和水源污染度的检测
专题2 :微生物的培养与应用
解尿素的脲酶的细菌才能生长。
（二）统计菌落数目 测定微生物数量的方法： 1、直接计数法：最常用的显微镜直接计数。 先将待测样品制成悬液，然后取 一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显 微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内 的微生物总数。 优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。 缺点：不能区分死菌和活菌； 难以计数微小的细菌。 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
实验设计
1.实验名称
土壤中某样品细菌的分离与计数 2.实验目的（略）
3.材料用具（略）
4.操作步骤 （1）土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消 毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先消毒 过的信封中。
（2）制备培养基
准备牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组）和选择培养
基。将菌液稀释相同的倍数（见教材23页“样品稀释流程
2、间接计数法：最常用稀释涂布平板计数法 应用：统计样品中活菌的数目 ①原理：当样品的稀释度足够 高时，培养基表面生长的一个 菌落，来源于样品稀释液中的 一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大 约含有多少活菌。
（注意）：一般选择菌落数在 30-300的平板 进行记数。
②操作：a、设置重复组：增强实验的说服力和准确性。 将待测样品经过一系列的稀释，选择三个稀释度的菌 液均匀涂布在平板上，然后培养。 （注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释 度菌液涂布到3个或3个以上的平板上，经培养，计算 出菌落的平均数。 教材中用楷体字编排的实例是为了说明设置重复组的重 要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复 组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置 重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板 的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可 能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数 值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时， 一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实 验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考 虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意 味着操作有误，需要重新实验。