脐血干细胞向不同体细胞分化的研究进展

脐血干细胞向不同体细胞分化的研究进展
籍凤宇;李佳佳;陈秀莉;马利兵
【摘要】脐血干细胞是一种具有多分化潜能的原始细胞,具备自我更新和增殖的能力,并能在特定因素的影响或诱导下,向多种细胞或组织分化.脐血来源的间充质干细胞不但可以分化为骨、脂肪和软骨,还可以转变成带有神经、肝脏及骨骼肌特异标
记的细胞,并且具有应用到组织损伤修复、基因治疗载体和造血干细胞共移植等方
面的潜力.旨在对于脐血干细胞在一定务件下分化为多种细胞研究进展进行综述.【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2012(000)001
【总页数】7页(P30-36)
【关键词】脐血;间充质干细胞;诱导;分化;组织
【作者】籍凤宇;李佳佳;陈秀莉;马利兵
【作者单位】内蒙古科技大学数理与生物工程学院,包头014010;包头医学院第一
附属医院,包头014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,包头014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,包头014010;包头师范学院生物科学与技术学院,包
头014030;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,包头014010
【正文语种】中文
脐血又称胎盘血或脐带血，是胎儿出生时脐带内和胎盘近胎儿一侧血管内的血液。

2000年，Erices等[1]报道脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cell/ mesenchymal progenitor cell, MSC/MPC）。

脐
血干细胞是近几年来发现的一类具有与骨髓干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞[2]。

脐血干细胞具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。

同时，脐血具有淋巴细胞抗原性弱、功能相对不成熟、移植后发生移植物抗宿主病的风险较低等特点，并且来源广，不受伦理和道德的限制，因此是干细胞移植的重要来源之一，具有广泛应用于临床组织工程学的巨大潜能。

研究诱导脐血MSC向神经元分化的方法是近年来研究的热点之一。

主要包括化学抗氧化剂、生长因子诱导和移植、共培养诱导等3种诱导方法。

侯玲玲等[3]采用
抗氧化剂β-巯基乙醇、二甲基亚矾及丁羟苯甲醚逐步诱导脐血MSC，诱导12 h
后70%细胞呈现典型的神经元样表型，表达神经特异性烯醇化酶和神经纤维丝，
且有神经元特有结构尼式体的形成。

人们对用这种方法诱导多能干细胞定向分化为神经细胞的确切机制并不清楚，但这些物质都是较为常见的抗氧化剂，可能是它们的抗氧化作用提高了体外神经细胞的生存水平。

Sanchez-Ramos等[4]以含上皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的培养基培养脐血单核细胞，用维甲酸和神经
生长因子进行诱导，使细胞表达Muasahi1、巢蛋白、β-微管蛋白-Ⅲ、神经元核
心蛋白及胶质纤维酸性蛋白。

Yan等[5]用含有碱性成纤维细胞生长因子和上皮细
胞生长因子的培养基培养脐血单个核细胞，可使脐血单个核细胞微管相关蛋白-2
的mRNA表达由未培养时的（58.27±2.27）% 增加到（89.15±1.18）% ，而使tau蛋白的mRNA表达由未培养时的无表达增加（83.24±1.28）%,这远远高于单独使用其中一种生长因子的作用。

Jeong等[6]用碱性成纤维细胞生长因子预诱导后，再用二甲基亚矾和丁羟苯甲醚
联合诱导脐血MSC,细胞向神经细胞快速分化，诱导5 h后细胞呈现出神经元样形态，24 h后可见类似于神经元结构，免疫荧光检测显示神经前体细胞标志巢蛋白（Nestin）呈阳性，成熟神经细胞标志物Tuj1、TrkA、胶质纤维酸性蛋白（glial
fibrillary acidic protein, GFAP）及微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2,MAP2）和NeuroD1呈弱表达，继续诱导后，巢蛋白表达明显减弱，
而Tuj1、TrkA、GFAP、MAP2和NeuroD1逐渐增强，提示细胞分化为未成熟
神经细胞。

Jeong等认为，采用bFGF预诱导脐血MSC是细胞向成熟神经细胞分化必不可少的步骤，若不进行预诱导，直接采用抗氧化剂诱导脐血MSC，细胞将
分化为平滑肌细胞。

与分泌神经营养因子的神经细胞共培养，也是重要的诱导方式。

Buzanska等[7]将脐血来源的巢蛋白阳性细胞与大鼠脑原代皮层共培养4 d后约40%的细胞分化为
神经元，约30%的细胞分化为星形胶质细胞，11%细胞分化为少突胶质细胞。

该
研究提示，脐血中不但含有MSC，而且可能存在神经干细胞，可分化为多种神经
细胞。

杜冀晖[8]观察人脐血干细胞（HUCB-SCs）蛛网膜下腔移植治疗中枢神经系统损
伤患者在体内向神经干细胞（NSCs）分化的状态。

采用流式细胞术检测HUCB-SCs蛛网膜下腔移植前后神经干细胞特异性标志物巢蛋白（Nestin）表达变化。

结果显示，HUCB-SCs蛛网膜下腔移植1周后，脑脊液中原始幼稚/干细胞
Nestin抗原荧光表达明显增强，Nestin阳性细胞占原始幼稚/干细胞比例为
（7.58±6.43）%，明显高于HUCB-SCs中Nestin阳性细胞比例（P<0.05）。

证实HUCB-SCs蛛网膜下腔移植后，在适当条件下在体内可以向神经干细胞分化，为脐血干细胞移植用于神经系统疾病的临床治疗提供较直接的客观依据。

间充质干细胞是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，研究发现，人脐带血中含有间充质干细胞，在一定的条件下能向肝细胞定向分化[9]。

目前体内诱导脐血干细胞为肝细胞的动物试验研究，主要以肝损伤的免
疫缺陷鼠为受体进行脐血移植的报道较多，并且多以细胞生长因子、中药材及放射线进行试验。

从体外移植脐带血干细胞可以减轻肝损害并促进肝细胞的再生，人脐
带血干细胞可以在急性肝损伤的大鼠体内分化为肝细胞。

张芳婷等[10]将脐血单个核细胞（MNC）与受损伤小鼠肝脏共培养以探讨人脐血干细胞是否可以在体外模
拟的肝损伤微环境中转化为肝细胞。

其研究结果证实在脐血单个核细胞与受损伤肝脏共培养的条件下，脐血干细胞有向肝细胞分化的趋向。

范烨等[11]观察肝细胞
生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）作用下，脐血干细胞在体内向肝细胞分化的情况。

利用HGF的裸DNA质粒通过尾静脉快速注入6-8周龄的非肥胖
糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，酶联免疫吸附法（ELISA）
检测外周血中HGF水平。

然后，收集足月妊娠产妇的脐血，磁式分选法选出
CD34+ 造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）。

20 μL CCl4腹腔注射
建立NOD/SCID小鼠急性肝损伤模型，分别输注CD34+ HSC和/或HGF质粒，观察其对死亡率、肝功能恢复的影响，并检测小鼠肝组织内的人源性细胞。

结果显示，快速注入HGF质粒后，体内HGF水平明显上升。

试验各组存活率及肝功能
恢复情况无明显差异。

病理切片显示，联合应用HGF+HSC的试验组，其肝组织
损伤程度最轻，单独应用HGF或HSC的两个试验组结果类似，对照组最重。

在
两组注射HSC的小鼠肝组织中，均可检测到人源性的、分泌白蛋白的肝样细胞，
且联合应用HGF的试验组中，此种细胞更多，分布更广。

试验结果显示，HGF可以促进脐血干细胞向肝细胞分化，并发挥肝细胞功能。

张永红[12]观察黄芪注射液在体内外促进脐血干细胞向肝细胞的分化,以及增强脐
血干细胞移植治疗大鼠肝衰竭的效果。

结果显示，不同质量浓度的黄芪制剂对人脐血干细胞生长影响不同，200 mg/L黄芪最适宜细胞生长和增殖。

与单纯加入肝细胞生长因子的人脐血干细胞比较，另加入200 mg/L 黄芪的人脐血干细胞白蛋白
免疫组化染色阳性细胞数明显增加（P＜0.05）。

随干预时间的延长，联合组、联合+ 环磷酰胺组、联合+ 地塞米松组肝脏组织白蛋白mRNA 的表达均强于鼠外周血单个核细胞组；而甲胎蛋白mRNA 的表达在早期均强于鼠外周血单个核细胞组，
在后期则表达消失。

干预7 d 后，联合组、联合+环磷酰胺组、联合+地塞米松组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶及总胆红素下降幅度均明显大于模型对照组、黄芪组和鼠外周血单个核细胞组（P＜0.05 ），而此3 组间各项指标的
变化无明显差异（P＞0.05）。

提示200 mg/L黄芪在体内及体外均可以促进人脐血干细胞生长并分化为肝细胞，减轻肝脏损害，增强脐血干细胞移植治疗肝衰竭的效果。

黄韬[13]将BALB/c裸鼠36只随机分成试验组和对照组，各18只；试验组再随
机分成A、B、C 3组，每组6只。

采用 60Co治疗仪γ射线对试验组和对照组行350 cGy的亚致死剂量照射，试验组A、B和C 3组照射后3 h内经尾静脉分别输入1.0×107个/只、2.0×107个/只和3.0×107个/只人新鲜脐血有核细胞，对照
组经尾静脉注入等体积无菌生理盐水。

1个月后对试验A、B组和对照组裸鼠经腹膜腔注射CCl4 ，试验C组注射等体积生理盐水。

2个月后采用免疫组化和RT-PCR方法检测裸鼠肝组织人源性CK18、CK19和人源性白蛋白（ALB）的表达。

结果显示，试验A组和试验B组裸鼠的肝组织人源性CK18、CK19和ALB表达
阳性，试验B组的表达强度高于试验A组（P＜0.05）；而对照组和试验C组裸
鼠肝组织CK18、CK19和ALB表达阴性。

证实脐血在CCl4导致的肝脏损伤的特
殊微环境内能分化为肝细胞，并表达白蛋白，其表达强度与输入的干细胞数量有关。

上述脐血干细胞体内诱导分化为肝细胞的研究成果主要是鼠源性的，那么在人体内脐血干细胞是否能够分化为成熟的肝细胞，或在体外给予合适的微环境的刺激，利用外界的微环境所提供的信号定向分化为肝细胞，以期为肝细胞移植和生物人工肝提供一种新的肝细胞来源。

唐晓鹏等[14]探讨了脐带血单个核细胞定向分化为肝细胞的能力及条件。

采集脐带血分离单个核细胞后，在试验组加入成纤维细胞生长
因子（FGF）及促肝细胞生长因子（HGF）、或成纤维细胞生长因子加胎肝上清液培养，对照组只加成纤维细胞生长因子培养，观察细胞生长分化状况，免疫组化检
测两组人甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）。

结果显示，试验组可见类圆形及多边形细胞，呈类肝细胞形态，对照组大多为梭形细胞，未见多边形细胞；试验组细胞甲胎蛋白和白蛋白免疫组化染色为阳性，对照组未见甲胎蛋白和白蛋白阳性细胞。

成纤维细胞生长因子的诱导分化效果优于胎肝上清液。

试验结论，脐带血单个细
胞在成纤维细胞生长因子或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌甲胎蛋白和白蛋白的类肝细胞。

Kakinuma等[15]采用去除脐血中的红细胞，获得有核细胞，以含15%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。

在培养过程中加入重组人纤维细
胞生长因子1（FGF-1）、重组人纤维细胞生长因子2（FGF-2）、重组人白血病
抑制因子（LIF）、重组人干细胞因子（SCF）、重组人肝细胞生长因子（HGF）、重组人抑瘤素M （OSM）诱导，经过7 d的培养，检测出ALB mRNA，14 d和21 d时ALB mRNA表达更多，第21天的表达是第7 天的40倍，培养21 d时
还检测出CK18、CK19和CS。

没有加入因子的对照组很少细胞贴壁，不表达
ALB mRNA。

表明在培养基中加入细胞因子FGF-1/2、LIF、SCF、HGF及OSM
可诱导脐血干细胞分化为肝细胞, 而且还可以作为肝移植的细胞来源。

熊中华等[16]初步探索了人脐血来源肝细胞的可能。

其研究采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得人脐血间充质干细胞，并冷冻保存，复苏后在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4 的联合诱导下，脐血来源的间充质干细胞可进一步分化为肝
细胞样细胞，已分化肝细胞可影响并诱导间充质干细胞分化。

免疫组化分析证实该类细胞表达肝细胞特异性标志和肝细胞特异的生物学活性，如表达CK8&18，分
泌胆白蛋白，胞浆内有糖原贮存。

目前诱导脐血干细胞分化为心肌细胞进行心肌移植，增加受损心肌部位有功能的心肌细胞数量，从而改善心功能已成为研究的热点。

人们多采用5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）进行诱导研究。

马南[17]研究犬脐血间质干细胞肌源性诱导后移植，移植细胞是否与宿主细胞形成功能性整合，检测细胞间连接的形成。

通过
分离、纯化和培养脐血MSCs，Laz-Z转染标记，5-氮杂胞苷肌源性诱导，将36
只杂种犬随机分为两组，建立犬心肌梗死模型。

细胞移植组：经冠状动脉和局部注射，将约107个MSCs移植到犬急性心肌梗死模型；对照组：用同样的方法注射
等量的生理盐水。

两组分别于2、4和8周时取组织切片，用免疫组织化学法检测细胞间连接。

结果显示，脐血MSCs呈梭形或纺锤形，克隆样生长；5-aza诱导
后肌源性分化，可表达α-actin（+），desmin（+），connexin43（+）。

移植的细胞可存活8周以上，移植细胞、移植细胞和宿主心肌连接处有cadherin和connexin43的阳性表达；而对照组仅有cadherin和connexin43的表达。

证实
脐血MSCs可在体外诱导为心肌样细胞，移植后能与宿主心肌形成有效连接，从
而具有通讯联系。

周苗子[18]观察脐血间质干细胞（UCB-MSCs）经冠脉移植入梗死心肌后对心肌
细胞和内皮细胞增生情况。

试验组将5-氮杂胞嘧啶核苷诱导分化后的UCB-MSCs 经结扎的冠状动脉左前降支远端灌注移植入心肌梗死区域，对照组予以注射相同剂量的PBS液。

1、2、4和8周后取心肌标本，应用放射免疫测定法检测心肌梗死
区细胞因子IGF-1、IL-1β和IL-8的表达及含量。

结果显示，UCB-MSCs移植1、2、4和8周后，试验组梗死区心肌IGF-1、IL-1β含量明显高于对照组
（P<0.01）；IL-8含量也明显高于对照组（P<0.05）。

证实UCB-MSCs移植入
梗死心肌，不仅有心肌再生，尚可通过细胞因子分泌对梗死区心肌血管再生起到促进作用。

余正堂[19]探讨了体外诱导脐带血干/祖细胞形成心肌细胞的可行性并寻找最佳诱
导条件。

将脐带血经Ficoll处理后提取单个核细胞层（MNC），在不同浓度的5-aza的DMEM培养基中诱导培养，用心肌特有的肌球蛋白重链（MHC）作免疫
组化标记诱导形成的心肌细胞。

结果用5-aza体外诱导培养能形成心肌细胞，仅
10 μmol/L形成的心肌细胞最多。

证实脐带血在体外培养条件下经5-aza处理能
诱导分化成心肌细胞，最佳浓度为10 μmol/L。

脐带血可作为修复损伤心肌的细
胞移植的一个来源。

由上可知，脐血细胞作为心肌组织工程的另一细胞来源是可行的，并具有应用幼稚细胞的特别优势和避免了对患者的侵入性损害。

胰岛细胞移植是目前治疗1 型糖尿病的最佳方法，但胰岛细胞的匮乏阻碍了这种
方法的广泛应用，寻找胰岛细胞新来源已成为全球糖尿病研究的热点之一。

侯萍[20]以密度梯度离心法体外分离人脐血单个核细胞，诱导1组首先以低糖DMEM
培养液进行培养，添加20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子，培养成巢蛋白阳性细胞后改为高糖DMEM培养液，添加2% B27和10 mmol/L尼可酰胺。

诱导2组直接以高糖DMEM培养液进行培养，添加20 mmol/L尼可酰胺、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L肝细胞生长因子、2%B27及0.1 mmol/L β-巯基乙醇。

对照组只添加与诱导组相同的培养液，不加入任何细胞因子。

诱导分化后对贴壁细胞进行形态学观察、胰岛素抗体的细胞免疫荧光染色及双硫腙染色鉴定，结果显示，体外培养的人脐血干细胞通过细胞因子组合诱导后，可见散在的胰岛样细胞或成群的胰岛样细胞群，呈Insulin阳性反应。

诱导1组细胞散在或成群分布，诱导2组则多为散在分布的胰岛样细胞，且细胞
相对较小，几乎没有胰岛细胞团。

双硫腙染色后诱导1组有少部分较大的胰岛样
细胞呈阴性，诱导2组细胞均呈棕红色阳性表达，未诱导的对照组细胞呈阴性。

试验证明，人脐血干细胞通过不同细胞因子组合诱导后具有向胰岛样细胞分化的潜能，但诱导1组中部分细胞可能是非胰岛素细胞，而诱导2组胰岛样细胞均一性
较差，可能与胰岛细胞种类较多、大小不一有关。

脐血间充质干细胞能够保持干细胞特性不断增殖，在不同的诱导条件下向不同的谱系分化，可分化为间质组织如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等。

1.5.1 向软骨细胞分化将脐带血MSCs经离心作用形成细胞团，并在含有转化生
长因子-β3的无血清培养基内培养，培养过程中，细胞中富含蛋白多糖的细胞外基
质逐渐增多，Nevo等[21]以维生素C，地塞米松，碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导，MSCs，细胞密度>1×106/cm2 ，诱导后软骨细胞的比例达到85%。

1.5.2 向骨细胞分化在含地塞米松、β-磷酸甘油及抗坏血酸的10%胎牛血清的培
养基中，MSCs逐渐形成骨结节，随时间的延长其中有钙盐沉积[22]。

1.5.3 向成肌细胞分化韩国一研究机构[23]将脐血间充质干细胞以5% 的马血清、0.1 μmol/L 的地塞米松、50 μmol/L的氢化可的松（hydrocortisone）诱导3 d 即有MyoD和Myogenin的表达，MyoD是一种肌细胞转录因子，被认为是肌细胞定向分化调控的主基因，调控下游肌细胞特异性基因库的表达，诱导6周即有
一半的细胞表达Myosin重链。

此外MSCs于5-氮胞苷，两性霉素-B反应后也可诱导出成肌细胞。

1.5.4 向脂肪细胞分化用含有1-甲基-3-丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及消炎痛的培养基诱导MSCs分化，结果分化的细胞内出现脂质空泡，并表达过氧化物酶
增多活性受体r2（PPARr2）、脂多糖脂酶（LPL）和脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白Ap2，且诱导分化率达95%。

细胞治疗是近年来飞速发展起来的一种高科技生物治疗手段，它是生物免疫治疗和基因治疗的重要组成部分。

造血干细胞移植就是最基础的细胞治疗手段，现已广泛应用于多种疾病的治疗，包括恶性血液疾病、遗传性疾病、重症免疫缺陷、AIDS、自身免疫性疾病，以及肿瘤放化疗后的造血支持治疗等。

脐带血中有大量的造血干细胞和间充质干细胞，且单份脐带血扩增后已能够满足成人移植所需要的单个核细胞数。

临床采用脐带血移植治疗疾病已有18年历史，已逐渐成为一种成熟的现代治疗技术，并将脐带血作为干细胞移植的重要来源.移植治疗的病种范围不断的扩大，现在已达80余种。

脐带血干细胞移植现阶段可治疗的疾病包括血红蛋白与血液异常的巨细胞缺乏性血小板减少症、再生障碍性贫血等；恶性疾病的急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病等；实体性肿瘤的脑瘤、何杰金病等；先天性代谢
性缺陷的脑白质肾上腺营养不良症、淀粉样变性等；免疫缺陷病变等腺嘌呤去氨
酵素缺乏、慢性肉芽肿疾病等：自体免疫疾病的多发性硬化症、风湿性关节炎等；其他还有脊髓损伤、糖尿病外周血管病变、冠状动脉粥样硬化性心脏病等80余种[24] 。

脐带血干细胞移植在神经科的应用近年来越来越广泛，其中对脊髓损伤的治疗应
用较广和成熟。

动物试验表明，脐血干细胞能定向迁移至受损神经组织并存活，
改善神经损伤后遗症。

在移植途径上Taylor等[25]的研究表明，经侧脑室穿刺法
移植的神经干细胞能直接突破血脑屏障，可以进一步迁徙至脑实质中，并与宿主
细胞在形态和功能上形成良好的整合，因此是一个干细胞移植的有效途径。

经腰
椎穿刺法移植神经干细胞在理论上具有同样的效果，而后者可能是将来临床干细胞移植更为实用、简洁的有效途径[26]。

造血干细胞移植治疗多发性硬化的基本原理是先用大剂量的免疫抑制化疗及放疗，尽量清除外周及中枢的异常淋巴细胞，再将预先采集的自体造血干细胞回输，利用干细胞的多系分化潜能，重建造血和免疫系统。

目前尚未见到有关用神经干细胞移植治疗多发性硬化的临床报道。

但动物试验显示，或通过外周静脉输入，或通过脑室和鞘内注射，神经干细胞和神经前体细胞均可迁移到炎症区域[27]。

病理组化染色证实，移植的干细胞在脑组织内能转变为少突胶质细胞，促进髓鞘修复，能加快实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠病情的恢复，进入非神经组织的神经干细胞则随着时间的推移而消失。

在急性脊髓损伤的动物模型中，胚胎干细胞、神经干细胞、脐带血干细胞和骨髓基质干细胞的移植治疗研究积累了大量的资料。

大多数试验结果显示，移植后的脊髓损伤动物在组织学和行为学的层次都有明显的改善。

脐血间质干细胞的发现和研究为临床工程学潜在的广泛应用提供了一种新的细胞源。

脐血细胞经过体外选择性培养后，具备与骨髓间质干细胞相同的多向分化潜能特性，
亦能像骨髓间质干细胞一样分化为破骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等组织细胞。

骨髓间质干细胞存在着细胞数量有限、难以即时使用等缺陷，因而需要寻找一种更理想的间质干细胞来源。

基于脐血干细胞有移植成活率高、移植物抗宿主病低、易于建立干细胞库、便于即时使用的特点，并且与其他类型的干细胞比较，取材方便，扩增数大，来源广泛。

在人类干细胞探索的科学进程中，脐血干细胞将以其自身的特性和优势占据重要的位置，具有重大的理论意义和潜在的临床应用价值。

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