胶体金的制备

胶体金的制备
胶体金的制备
根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。

在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。

使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。

即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。

还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。

粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。

因此一般胶体金探针均使用该方法进行。

但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。

此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。

双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。

但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。

因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。

磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。

注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。

配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 um微孔滤膜过滤后使用。

三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。

制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保
存1-2个月。

当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。

但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金
(1) 取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。

(2) 取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。

预热至60～70℃。

K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。

因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。

(3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。

自然冷却。

柠檬酸钠（ml）单宁酸（ul）胶体金（nm）
4 5000 3
4 2000 4
4 500 6
4 120 8
4 70 10
4 10 16
2、白磷还原法制备5 nm胶体金
(1) 取250 ml三角瓶一个，加79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3将溶液调至中性（pH7.0）。

(2) 取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0.8 ml 乙醚，混匀。

取0.7 ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。

(3) 室温下轻轻摇匀15 min，然后加热沸腾并保持5 min，自然冷却。

3、柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金(Frens, 1973)
(1) 取250 ml三角瓶一个，加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金，加热沸腾；
(2) 取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。

混匀，再保持沸腾30 min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。

注意：
(1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。

如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。

(2) 胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。

但决不可保存在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体的制备
一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。

胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH 值，在pH=pI 时为中性。

由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。

但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。

（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。

（3）使蛋白具有适当的分子量。

蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。

而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。

把分子量过小的蛋白与其它
蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。

对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为
重要。

过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的探针。

在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。

不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。

一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。

但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。

这要靠实验验证。

在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。

如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。

因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。

在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。

这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH 也有一定变化。

因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。

1、抗血清的前处理
一般抗血清中IgG的含量为10-25%，而绝大部分为其它蛋白。

用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。

因此需去除其中多数杂蛋白。

但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。

如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。

大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。

其基本步骤如下：
(1) 取抗血清0.2 ml；
(2) 加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀；
(3) 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置1 h；
(4) 10000 rpm/min离心20 min，弃上清；
(5) 加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；
SO4，充分振荡混匀，4℃静置1 h；
(6) 逐滴加0.25 ml饱和 (NH4)
2
(7) 10000 rpm/min离心20 min，弃上清；
(8) 重复5～8步骤一次；
(9) 加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；
(10) 生理盐水中透析12～24 h；
(11) 在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12～24 h；
(12) 分装，即将使用时4℃保存，备用-20℃保存。

为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4℃下进行。

对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。

如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针。

2、亲和纯化抗体的处理
亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。

一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。

这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。

因此前处理的目的在于脱盐和解聚。

其基本步骤如下：
(1) 将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0.5-1 mg/ml浓度
(2) 在3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析12 h
(3) 在2 mMol pH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h（更换透析液数次）
(4) 分装备用
其它蛋白可参考此方法进行。

但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。

在实际运用中，一般省略去3M KCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。

我们建议在制备通用探针（如二抗IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。

3、IgG Fab片段的制备
一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。

主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。

IgG分子量为150 kD左右，由4个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。

用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。

其中Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。

Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合。

但这种分离只能在有条件的实验室进行。

其基本过程如下：
(1) 用PBS（pH 7.0，含10 mM EDTA，20 mM盐酸半胱氨酸）溶解纯化的IgG
(2) 加固化木瓜蛋白酶
(3) 37℃处理5h
(4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）
(5) 过Protein G柱
(6) 纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理
注：Fab与胶体金结合的pH值为6.5
4、蛋白与胶体金结合最佳pH测定
(例纤维素酶，pI未知)
(1) 取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 10 nm胶体金；
(2) 用25 mM K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；
(3) 取一96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100 ul加入孔中，重复三次；μ
ul浓度为1 mg/ml的纤维素酶，混合，室温下放置10-15 min；μ(4) 每孔分别加入3
(5) ul浓度为10％ NaCl溶液，混合，室温下放置10 min；μ每孔分别加入20
(6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；
(7) 重复(1)-(5)步，pH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。

(8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。

注意：
1．如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加NaCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。

必要时可放大反应体积（1 ml胶体金），并借助离心来判断。

2．有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。

5、最小蛋白浓度的确定
(1) 用0.22 um微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；
(2) 取一96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳pH的胶体金100 ul，重复3次；
(3) 各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.05-0.1 mg/ml）1～20 ul，混匀，室温下放置15min；
(4) 加入20 ul 10％ NaCl，室温下放置10min；
(5) 颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。

(6) 为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。

注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的130％。

6、IgG-gold的制备
(1) 取两个1.5 ml试管，分别加入1.2 ml 10 nm胶体金；
(2) 加入适量25 mM K2CO3把pH调整为9.0；
(3) 分别加入10 ul浓度为1 mg/ml IgG，混匀，室温放置10min；
(4) 分别加入12 ul 2% PEG20000，室温放置5 min；
(5) 10000 rpm离心20 min，轻轻吸除上清；
(6) 用20 ul BL溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中；
(7) 分别加20 ul 甘油，充分混匀；
(8) -20℃保存备用。

注意：
1).不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；
2).不同直径胶体金所需离心速度完全不同。

以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。

离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；离心力太小，探针无法沉下。

最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。

3).在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。

4).IgG的最佳交联pH有多种报导，从7.4-9.0。

一般认为，7.4时胶体金结合的蛋白最多，9.0时制备的探针最稳定。

三、样品的固定、包埋与标记
1．固定
C以下。

?为了减少对标记底物结构的破坏，细胞化学样品固定的时间相对较短，多为1-3小时。

环境温度一般在25
-1,3-葡聚糖、几丁质等），可用常规方法进行4%戊二醛和1%锇酸的双固定。

β低温固定剂一般采用2-3%甲醛与1%戊二醛。

甲醛分子量小、渗透快，对蛋白质结构影响小，可较好地保存其抗原活性。

但对细胞整体的细微结构保存欠佳。

戊二醛对细胞的细微结构保存较好，但往往导致蛋白失去抗原活性。

因此，在标
记低物不是蛋白质或多肽时（如纤维素、多酚类化合物、
2．包埋
根据标记低物的不同，可以选择常规（常温）包埋剂或低温包埋剂包埋样品。

如果标记物为蛋白质，特别是性质不稳定或不清楚时，建议使用低温包埋剂包埋，以最大程度保存抗原活性。

大量实验表明，K4M是目前使用最为普遍的低温包埋剂。

当选择常温包埋剂时，建议使用Spurr包埋剂。

Spurr包埋剂粘性小，易渗透，易操作；包埋块不吸潮，保存时间长。

3．标记
根据标记程序的不同，标记分直接与间接标记。

直接标记指胶体金探针直接与被标记底物结合；而间接标记指胶体金探针通过一或多
个中间标记物后与底物结合。

直接标记间接标记
直接标记需要制备胶体金探针，其好处是标记特异性好，背景小，能够做阴性对照。

间接标记无需制备胶体金探针，可以直接购买通用二抗探针，缺点是标记特异性较难把握，背景较高，不能够做阴性对照。

在做病毒粒子标记时，直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任何背景。

影响标记的因素主要包括以下方面：
（1）pH
pH变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响，继而影响到标记强度与特异性。

在很多情况下探针作用的最佳pH值往往与该蛋白作用的最佳pH值有一定差别。

例如有一种来自真菌的纤维素酶本来在pH 4.8时活性最强，但结合到胶体金上后，pH在6.0左右时最强，当pH到7.2时仍有较强的标记活性。

（2）离子环境
有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性，其中很多涉及Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+等阳离子。

有时溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标记失败；因此，在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍，添加顺序及溶液pH。

（3）温度
标记温度对标记活性及特异性影响最大，也最容易出问题。

以水解酶类做成的胶体金探针对温度变化也更为敏感，不同温度、不同时间标记出的切片其视觉效果完全不一样。

在此特别指出一点，在用内切的水解酶探针时，切忌温度过低，时间过长，否则会出现标记的扩散现象。

建议在可能时尽量使用外切酶探针。

在使用IgG或Protein A，Protein G探针时，有人认为在4℃下长时间标记特异性最好。

但我们研究发现事实并非如此，在25℃以上的室温下标记20-60 min其特异性更好。

一般来说，如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最
好在25℃左右；用来自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在30℃左右。

（4）封闭液组成
封闭液对封闭有关非特异性活性基团，特别是醛基至关重要。

在多数情况下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液是一样的。

目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG20000等。

在用IgG、Protein A、Protein G等标记时，应优先选用BSA(组分五)；在植物凝集素类探针标记时，应优先选用PEG20000。

也有人发现IgG 探针标记时脱脂奶粉最佳。

如果是用交联蛋白做成的探针，那么封闭液中最好有载体蛋白的成分
1.超过了判读时间结果还准确吗？
答:结果不准确，应按照说明书规定的时间判读。

如果到判读时间为止，结果为阴性，判读时间以后，出现淡淡的线条，可能是有色标记物持续释放造成的，但是这种结果是无效的。

2.使用冰箱保存的标本和产品，应该注意什么？
答：若标本、试剂、缓冲液冷藏后，检测前应把冷藏过包装完好的检测试剂、缓冲液放置空气中复温，冷藏或冷冻的标本检测前也应复温。

如果没有与室温平衡即开始检测，空气中的水分遇冷凝集在没有复温的试剂上，导致产品受潮，可能影响测试结果。

如果冰箱湿度较高，不建议开封过的筒装产品在冰箱内保存。

3.样品移行速度特别慢或无样本跑动现象（在反应窗内不见有液体在膜上流动）
答：加入的标本量或全血加稀释液的量不够：重新试验。

包装袋破损或试剂失效：重新试验。

从冷环境取出后没复温：重新试验。

诊断试剂装配不当：与供应商联系。

4.在反应窗内见到红色竖线
答：当样本在膜上流动时可能发生：该情况不会影响检测结果，但保证背景清晰的情况下在规定时间内读取结果。

可能使用了已溶血样本：用新鲜标本重新测试。

5.规定的结果读取时间时未见 C 线？
答：加入的样本量不够：重新测试，按说明书要求加入足够的样本量。

加入的样本量太多，导致产品流动不正常：按照说明书要求滴加样本量。

样本不流动，试剂有问题：与供货商联系。

用血清血浆试剂检测全血：用对应的标本检测。

6.检测后出现假阳性结果
答:血清/血浆样本中含有特殊干扰物质：用另外的方法确诊检测结果。

在超过规定时间后读取结果：不要在说明书规定读数时间后读取检测结果。

7.检测后出现假阴性结果
答：样本中被检样本浓度低于检测阈值：用其它检测方法确认。

该样本含有的亚型较为特殊或者病毒变异能力强：用其它检测方法确认该患者是否为阳性。

很淡的线条客户判为阴性：仔细阅读说明书，按照指定的判读方法判断。

没到规定的时间提前判定结果：仔细阅读说明书，按照指定的判读方法判断。

幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制
作者：张宝元，王晓伟，崔小
【摘要】目的建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。

方法以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。

结果用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。

胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ ml。

SPA标记的最适pH 为6.0。

以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间
阳性率比较差异无显著性。

结论胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。

【关键词】幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测
Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG
【Abstract】Objective Developing gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG and optimize the key experiment conditions.Methods Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcus protein A (SPA)，set up the gold immunochromatography test kit for serum H.pylori antibody IgG.Results The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright red.The minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA i s 5μg/ml，and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ml.The pH 6.0 is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA，there is on significant difference between two methods.Conclusion The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors，such as the quality and quantity of antigen or antibody， colloid gold particles，buffers，etc.
【Key words】helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay
在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。

而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。

20世纪80年代
兴起的胶体金免疫层析检测（gold immunochromagraphy assay，GICA），操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，特别适于基层卫生单位使用。

本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA）抗原，尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG 抗体的胶体金免疫层析检测试剂，优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件，为进一步研制和开发奠定实验基础。

1 材料与方法
1.1 材料
幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存；TSB肉汤（Tryptic soy broth）为DIFCO 公司产品；氯金酸（HAuCl4.H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。

厌氧培养罐AnaeroPack Rectangular Jar为三菱化学公司产品。

1.2 方法
1.2.1 玻璃器皿的清洁
制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。

1.2.2 胶体金颗粒的制备
取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。

1.2.3 免疫胶体金复合物的制备
1.2.3.1 胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定
目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9～6.2，取11支洁净试管分装胶体金溶液（1ml/管）。

将待标记蛋白质SPA逐级稀释后（由2～10μg另
设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置。

依表1顺序进行。

表1 胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验（略）(1)室温静置2h以上观察结果；(2)未加SPA的11号管为对照管；1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。

以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。

在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。

1.2.3.2 最适标记pH的确定
调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低稳定量实验，确定标记蛋白的最佳标记pH。

1.2.3.3 SPA标记胶体金
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。

具体步骤如下：按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。

在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9～6.2），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。

分别取1ml胶体金-SPA结合物液（实验
组）和1ml胶体金原液（对照组）于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白SPA。

最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000），继续搅拌30min。

1.2.4 胶体金标记SPA复合物的纯化
超速离心法纯化免疫胶体金复合物。

先以3500rpm离心20min （4℃），弃沉淀将上清以13500rpm离心35min（4℃），弃上清，用保存液悬起较疏松的红色沉积物；再以11000rpm离心35min （4℃），小心移弃上清后，用保存液悬起较疏松的红色沉积物至原体。