饲料及饲料原料中霉菌毒素检测方法的研究进展

饲料及饲料原料中霉菌毒素检测方法的研究进展
作者：张明黄解珠龙俊敏等
来源：《江西饲料》 2018年第1期
摘要：霉菌毒素污染饲料后会降低其养价值，引起动物疾病，并危害人类健康，应当建立
相应的检测体系。

饲料中霉菌毒素的检测方法主要有目测法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS/MS）、气相色谱和气相色谱-质谱联用法（GC 和GC-MS）、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫层析法（IC）、分子生物学检测等。

综述
了霉菌毒素常见检测方法的研究进展和应用。

关键词：霉菌毒素；饲料；检测方法
中图分类号：S816.17 文献标识码：A 文章编号：1008-6137（2018）01-0001-04
0 引言
霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的高毒性有毒次级代谢产物，广泛存在于食品、饲
料及其原料中，目前发现的霉菌毒素有300～400种。

根据联合国粮农组织（FAO）统计，全球
每年不同程度受霉菌毒素污染的农作物大约占25%，约2%的农作物因严重污染而失去价值，由
此造成的经济损失每年可达数千亿美元[1]。

我国饲料中霉菌感染率极高，我国配合饲料受不同程度霉菌毒素污染达到80%以上，每年直接经济损失达500 亿以上。

给畜禽饲喂含有霉菌毒素的饲料，将导致采食量下降、生产性能降低，严重者可直接导致
畜禽死亡[2]。

霉菌毒素在动物体内不易降解，又可通过食物链进入人体，对人体造成损害。

霉菌毒素一般通过以下途径危害身体：（1）霉菌毒素与机体的DNA 和RNA结合，抑制其合成进
而影响蛋白质合成，从而降低动物的免疫力。

（2）霉菌毒素通过改变细胞膜的结构，诱导发生脂质过氧化，影响抗氧化酶的活性，诱发细胞的过氧化反应。

（3）霉菌毒素诱导细胞凋亡。

随着人民生活水平的提高，霉菌毒素作为影响饲料品质和人类健康的重要因素已被大家所
认识。

对饲料中霉菌毒素的定性和定量检测为人畜防范其为害提供了有力保障。

现对国内外霉
菌毒素的检测方法进行综述。

1 目测法
在饲养畜禽时，如果出现动物拒食、饲料发热、有轻度异味、色泽变暗、饲料结块等现象，饲料可能霉变。

霉菌菌丝体与饲料交织在一起，形成菌丝蛛网状物，这些结构使得饲料结块，
说明菌丝体已经在大范围内生长繁殖。

饲料结块是诊断饲料霉变的最简单实用的方法之一，不
同的霉菌菌落特征不一，要进一步确定可通过显微镜检测确认。

2 薄层色谱法（TLC）
TLC适用于多种霉菌毒素的定性和定量检测，也是我国测定食品和饲料中霉菌毒素的国家
标准方法之一。

其原理是用合适的提取液将霉菌毒素从不同样品中提取出来，经柱层析净化，
再在薄层板上层析展开和分离，再用吸收法或荧光法对被测样品与标准品进行扫描测定其最低
含量。

Marijana[3]报道，采用TLC对测定饲料中单端孢霉烯族毒素、T-2 毒素、蛇形毒素及脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，其检出率分别为16.8%、27.6% 和41.2% ，含量在0.05~3.4 mg/kg
之间。

TLC 法简单、快速，设备简单且成本低，但样品前处理比较复杂，分离效率、灵敏度和
回收率都较低，现主要用于定性分析。

3 高效液相色谱法（HPLC）
HPLC法是当前检测霉菌毒素最常见的的方法。

常用的检测器有荧光、紫外、二极管阵列、
蒸发光散射等。

Gerda为测定谷物中串珠镰刀菌毒素的含量，先将样品进行一系列前处理后，
用HPLC-FLD法检测，荧光检测器激发波长为330 nm，发射波长为440 nm。

在20～250μg/kg
添加水平上回收率为70%，LOD为20μg/kg[4]。

HPLC法有灵敏度高、检测限低、易于规范化操作，有广泛的适用性，HPLC法已成为实验仪器设备比较完善的实验室常用的分析方法。

4 高效液相色谱- 质谱联用法（HPLC-MS/MS）
液相色谱－串联质谱（LC-MS）法和超高效液相色谱－串联质谱（UPLC-MS）是结合了液相
色谱的高分离度、高灵敏性和质谱检测器的通用性、高灵敏度、选择性好、可提供分子结构信息、前处理简单等优点，是当前较为先进的霉菌毒素检测方法[5]，经常作为确证方法使用。

Aleksandrs等[6]报道，采用HPLC-ESI-MS/MS 检测谷物中的杂色曲霉毒素，样品经前处理后。

在正离子检测方式下，离子源温度为120℃，锥孔电压为30 V，毛细管电压为3.5 k V，m/z [M+H]+为325，选择两个离子（310 和288）组成两对监测离子对，回收率为94.5%～105.3％，LOD 为0.15 μg/kg，LOQ为0.30 μg/kg。

任一平[7]报道，采用UPLC-MS／MS对饲料中包括
青霉菌类毒素、曲霉菌类毒素、镰刀菌类毒素等在17种霉菌毒素进行检测，在ESI+电离方式下，10种霉菌毒素的LOQ范围为0.01~0.20μg/kg；在ESI-电离方式下，７种霉菌毒素的LOQ
范围为0.20~0.50μg/kg。

但是这种方法需要的仪器设备昂贵，并且检测成本较高，操作步骤
复杂且速度慢，所以目前该方法在国内的普及率较低。

5 气相色谱和气相色谱-质谱联用法（GC 和GC-MS）
GC 和GC-MS技术具有分离速度快、灵敏度高等优点，但气相色谱只适用于挥发性较大同时热稳定性较高的物质的分离检测，所以现主要用于镰刀霉菌毒素和展青霉素等的检测。

Llovera 报道，直接用MS检测苹果汁中展青霉素含量为4 μg/L[8]。

Zsuzsanna [9]用GC-FID 或GC-
MS 检测玉米中的单端孢霉烯族毒素，GC-FID 的回收率为66%～109％，LOD 为0.3～0.7 mg/kg，GC-MS 的回收率为87%～100％，LOD 为0.05～0.35 mg/kg。

气质联用法不仅能对霉菌毒素做准确的定性分析，而且检测的灵敏度也有大幅度的提高，检测限更低。

6 酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA 法是利用免疫学原理，将已知抗原吸附在酶标板上，加入酶标抗体和样品提取液均
匀混合，充分反应后洗去多余抗体，加入底物，产生显色反应，最后加入终止液终止，用酶标
仪测定酶底物的降解量，参照标准曲线计算试样中的抗原含量。

郭成志[10]报道，用ELISA 法
检测饲料中的青霉酸，最低检测浓度为1. 6μg/mL；线性范围为0. 1～25.6μg/mL；回收试验的平均回收率分别为85.36%。

ELISA由于操作简单、检测速度快，成本低，使用安全适用于大
批量样品的快速检测。

但由于抗体的制备较困难，限制了该检测方法的应用。

根据真菌毒素检
测的特点，现常采用间接竞争ELISA 和直接竞争ELISA。

7 免疫层析法（IC）
免疫层析法（IC）是以免疫学为基础发展起来的一种检测方法，它具有检测面广、操作方便、快捷迅速、特异性强、灵敏准确、携带方便、安全环保、经济实用等优点，特别适于大批
量样本的快速检测和基层使用，具有广阔的应用前景。

目前，胶体金免疫层析(GICA)就是以胶
体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。

在毒品检测方面得到了
广泛应用，并已初步应用于食品和饲料安全检测。

但在实际应用中也出现假阳性、假阴性、检测灵敏度不高、检测范围扩大等现象。

朱丽报道，用胶体金免疫层析法检测圆弧青霉毒素-青霉酸，胶体金颗粒大小为20 nm，pH值为8.2，包被标记抗原量为0.4 mg/mL，标记抗体量为
25μg/mL时，试纸的显色效果最好，青霉酸快速检测试纸条的灵敏度为5μg/mL，检测时间为10 min[11]。

8 分子生物学检测方法
随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术也应用到霉菌毒素分析和检测中。

秦文彦等报道，根据黄曲霉毒素生化反应的关键调控基因，建立了检测产黄曲霉毒素的单管多重PCR 反应体系，对6 种曲霉和1 种青霉DNA 样品进行检测，灵敏度为1 ng/μL。

该方法具有高效、快捷且成本低等优点[12]。

最近几年噬菌体展示技术（PDT）也应用到饲料安全快速检测体系中。

黄思敏等报道，利用噬菌体展示技术建立了桔青霉素的检测的竞争ELISA 法，检测的下限为10 ng/ L[13]。

利用PDT技术先后得到了呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)[14]，黄曲霉毒素
B1[15]，赭曲霉毒素A[16]，玉米赤霉烯酮[17]等的模拟表位肽。

利用模拟表位肽替代试纸条
显色区中相应的毒素-载体蛋白，不但可以增加检测人员的操作的安全性，也减少了霉菌毒素对环境的污染，而且该方法安全、快速，降低了检测成本。

霉菌毒素的危害性已引起人们的高度重视。

霉菌毒素的快速、精确检测方法是当今需解决的热点问题。

现有的检测方法各有优缺点，随着科学技术的不断进步，特别是免疫学、分子生物学的不断发展，霉菌毒素检测技术更加快速准确、操作简单，各种检测技术也在不断更新。

人们已建立了很多快速、简便、特异、敏感、低耗的检测霉菌毒素的方法。

密切关注国外新技术和引进国外方法，推出适合我国霉菌毒素的检测技术，对加强饲料安全的控制，保证国人身体健康，促进社会经济发展具有重大意义。