NDV感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖

·研究论文·
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报摘 要：新城疫病毒（NDV ）属于单股负链病毒目（Mononegavirales ）副粘病毒科（Paramyxoviridae ）禽副粘病毒属（Avulavirus ）。

核不均一核糖体蛋白A1（hnRNPA1）在细胞核结合并影响前体mRNA 的剪切和成熟mRNA 的转运。

为研究hnRNPA1是否调控NDV 感染，本研究通过间接免疫荧光实验检测了hnRNAP1在病毒感染过程中的亚细胞定位。

结果显示，NDV 感染促进hnRNPA1蛋白出核，并与病毒核衣壳蛋白NP 共定位；免疫共沉淀实验证实，hnRNPA1分别与病毒核衣壳蛋白NP 和病毒膜蛋白M 相互作用；以siRNA 干扰hnRNPA1的表达，NDV 增殖受到抑制，过表达hnRNPA1则促进NDV 增殖。

上述结果表明，NDV 感染促进部分hnRNPA1进入细胞质，与病毒NP 蛋白相互作用并促进病毒增殖。

该研究结果为hnRNPA1参与副粘病毒复制的研究奠定了理论基础。

关键词：新城疫病毒；核不均一核糖体蛋白A1；核输出；M 蛋白；NP 蛋白中图分类号：S852.659.5
文献标志码：A
文章编号：1674-6422（2021）05-0007-06
NDV Infection Promotes hnRNPA1 Nuclear Export and Benefi ts Virus Proliferation
JIANG Weiyu, DING Chan, LIAO Ying
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)
收稿日期： 2019-04-17
作者简介： 姜维雨，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：NDV 感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖
姜维雨，丁 铲，廖 瑛
（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）
2021,29(5): 7-12Abstract: Newcastle disease virus (NDV) belongs to the genus Avulavirus of the family Paramyxoviridae in the order Mononegavirales. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1) interacts with pre-mRNAs in the nucleus and is involved in the processing of pre-mRNA and transport of mRNA. To investigate whether hnRNPA1 regulated NDV infection, we checked the subcellular localization of hnRNPA1 upon NDV infection. We found that NDV infection induced hnRNPA1 nuclear export as shown in indirect immunofl uorescence assay. The cytoplasmic hnRNPA1 co-localized well with viral nucleocapsid protein NP, which was located to the virus replication complex. Co-immunoprecipitation experiments demonstrated that hnRNPA1 interacted with viral protein NP and M, respectively. When the expression of hnRNPA1 was interfered by using siRNA, NDV proliferation were suppressed whereas overexpression of hnRNPA1 promoted virus proliferation. These results suggested that during NDV infection, a proportion of hnRNPA1 was exported from nucleus to the cytoplasm and bound to viral protein NP, promoting viral RNA synthesis and increasing virus replication. This study shed light for the study of hnRNPA1 involved in paramyxovirus replication.
Key words: NDV; hnRNPA1; nuclear export; M protein; NP protein
· 8 ·中国动物传染病学报2021年10月
新城疫是危害养禽业的一类动物疫病，由感染新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为症状，具有很高的发病率和死亡率。

NDV 基因组RNA长度为15 186 bp，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphate protein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（large protein，L）。

P基因还通过RNA编码两个非结构蛋白：V和W。

NP的氨基端包裹病毒基因组RNA，以避免其被降解[1]；其羧基端则发挥RNA聚合酶的作用[2]。

M蛋白为疏水蛋白，没有跨膜区，位于囊膜与核衣壳之间。

在病毒复制早期，M蛋白定位于细胞核内；在病毒复制晚期，M蛋白出核到达细胞膜，与F蛋白和HN蛋白相互作用，并与核衣壳结合，最终完成病毒粒子组装和出芽。

另有研究表明，M蛋白负责维持病毒核衣壳的球形形状[3]。

核不均一核糖体蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）有A和B两个亚家族，主要分布在细胞核内，与细胞核中的前体mRNA相互作用， 影响前体mRNA的加工以及mRNA的代谢和转运[4]。

该家族的典型成员hnRNPA1广泛参与转录调控和mRNA的加工[5]，并跟神经退行性疾病相关[6]。

hnRNPA1通过以下方式发挥功能：（1）转录调节：在转录过程中，hnRNPA1结合到双链DNA上的特定靶序列，形成蛋白-蛋白复合物，抑制转录[7]；（2）mRNA拼接控制：真核生物的蛋白质组多样性在很大程度上取决于前体mRNA选择性拼接的程度，而hnRNPA1能影响剪接体对前体mRNA选择性剪接位点的选择；（3）应激颗粒的组装：应激颗粒是细胞压力应激时在细胞质中形成的蛋白和RNA聚集颗粒[8]。

hnRNPA1因其RNA结合特性以及与蛋白质相互作用而参与应激颗粒的组装[9]；（4）MicroRNA的加工；（5）端粒延长。

已有研究结果表明，hnRNPA1促进非典型肺炎冠状病毒[10]、鼠肝炎病毒[11]、猪流行性腹泻病毒[12]、肠道病毒[13]，以及辛德毕斯病毒[14]的复制。

然而，hnRNPA1对副粘病毒复制的影响尚未有报道。

本研究发现，NDV感染可促进hnRNPA1从细胞核进入细胞质，并与NDV核衣壳蛋白NP发生共定位和相互作用。

考虑到hnRNPA1和NP均有RNA 结合能力，我们推测hnRNP A1通过NP蛋白结合到病毒RNA基因组，参与了病毒基因组的复制和转录过程。

1 材料与方法
1.1 主要试剂Flag-HRP抗体及HA-HRP抗体购自MBL公司；anti-hnRNPA1抗体购自CST公司；RIPA 购自碧云天生物技术有限公司；TRIzol裂解液购自Thermo Fisher公司；反转录酶MLV购自Promega公司；Anti-Flag抗体亲和凝胶购自Bimake公司。

1.2 细胞与病毒 HeLa细胞及293T细胞购自ATCC，并由本实验室保存。

培养于含10% FBS（Gibco）、双抗（细胞培养用青霉素-链霉素）的DMEM，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

NDV标准强毒株Herts/33由中国兽药监察所提供，本实验室保存。

1.3 NDV感染以5×105个HeLa细胞铺6孔板，待细胞长至70%~80%时用PBS洗细胞3次，无血清DMEM 稀释NDV，以1 MOI（multiplicity of infection）感染细胞，置于37℃、5%CO2培养箱吸附1 h。

PBS清洗细胞3次，去除未吸附的病毒后，更换为2% FBS DMEM培养基继续培养。

1.4 间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA） 以4%多聚甲醛室温固定细胞15 min；
0.5% TritonX-100室温透化细胞15 min；以3% BSA 37℃条件下封闭1 h；37℃孵育anti-NDV NP鼠源单克隆抗体2 h，37℃孵育Alexa Fluor 488 nm goat anti-Mouse IgG荧光二抗1 h；37℃孵育anti-hnRNPA1兔源抗体2 h；37℃孵育Alexa Fluor 594 nm goat anti-Rabbit IgG荧光二抗1 h；室温孵育DAPI染色液10 min。

在载玻片中央滴一滴抗荧光猝灭封片剂，取出细胞爬片倒扣于封片剂上，室温避光风干，使用蔡司激光共聚焦显微镜观察。

1.5 质粒转染以每孔5×105个HeLa细胞铺板。

待细胞长至60%~80%时，使用Fugene HD转染试剂进行质粒转染。

· 9 ·
姜维雨等：NDV 感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖第29卷第5期1.6 免疫共沉淀 以8×107个293T细胞铺100 mm 培养皿。

12 h后，分别转染质粒Flag-M和HA-hnRNPA1、Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、pCMV-Flag载体和HA-hnRNPA1各3 µ
4 h。

以2400 ×g 1.7 s i R N A 设计及s i R N （G e n B a n k 登录号：X M _005268826）基因序列，设计siRNA（序列为5'-AGCAAGAGATG GCTAGTGC-3'），由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时合成一段无义对照s i N C （序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）。

待细胞长至40%时，用Lipofectamine 2000进行siRNA转染。

36 h后，以1 MOI的NDV感染。

感染后12 h收取细胞样品，Western blot检测干扰效果和病毒蛋白的表达，或荧光定量RT-PCR检测病毒的RNA水平。

1.8 SDS-PAGE 及Western blot 鉴定 将蛋白样品室温离心10 min后取10 µL上样，进行SDS-PAGE电泳，并转印至NC膜上。

5%脱脂乳室温封闭NC膜1 h后，4℃孵育一抗过夜，PBST洗3次，再室温孵育NC膜和HRP标记的二抗1 h，PBST洗3次。

然后将NC膜置于发光液中孵育2 min，在化学图像分析仪中显影并保存图像。

1.9 细胞RNA 抽提、反转录及荧光定量PCR 6孔板每孔加1 mL TRIzol细胞裂解液抽提RNA，将细胞裂解液移入无RNA酶离心管中，加入200 mL氯仿，剧烈震荡15 s。

静置5 min后，13 700 ×g 、4℃离心15 min，小心吸取上清液至新的无RNA 酶离心管。

加入200 mL异丙醇，-20℃沉淀2 h。

13 700 ×g 、4℃离心15 min，弃上清液，加入75%乙醇，13 700 ×g 、4℃离心10 min。

彻底弃去上清液，室温风干至乙醇完全挥发。

加入30 μL DEPC 水，65℃孵育15 min溶解RNA，使用分光光度计测量RNA浓度。

取3 µg RNA进行反转录，获得cDNA。

以cDNA 为模板，采用SYBR Green染料法进行荧光定量RT-PCR，引物如表1所示。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃β-actin-R GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA NDV NP-F CAACAATAGGAGTGGAGTGTCTGA NDV NP-R
CAGGGTATCGGTGATGTCTTCT
2 结果
2.1 NDV 感染导致hnRNPA1出核 以1 MOI NDV标准强毒株Herts/33感染HeLa细胞，Mock感染为对照组。

利用NDV NP鼠源抗体及hnRNPA1兔源抗体进行免疫荧光实验，检测病毒蛋白NP和hnRNPA1的亚细胞定位。

结果可知，在Mock感染的细胞中，hnRNPA1聚集于细胞核；NDV感染16 h，少量的hnRNPA1蛋白出核进入细胞质，并与病毒核衣壳蛋白NP共定位（图1）。

以上结果表明，NDV感染促进hnRNPA1出核，迁移至病毒核衣壳蛋白NP所在位置。

NP
hnRNP A1
Mock
NDV
DAPI
Merge
图1 NDV 病毒感染诱导hnRNPA1蛋白出核，与病毒
蛋白NP 共定位
Fig.1 NDV infection induced hnRNPA1 nuclear export
and co-localized with viral protein NP
2.2 NDV NP 和M 蛋白与hnRNPA1存在相互作用 在非典型冠状病毒、鼠肝炎病毒及猪流行性腹泻病毒感染过程中，感染引起hnRNPA1出核，并与病毒核
· 10 ·中国动物传染病学报2021年10月
衣壳蛋白NP相互作用，影响病毒基因组RNA的复制。

通过免疫荧光实验发现，hnRNPA1出核后，与NDV核衣壳蛋白NP共定位。

NP结合病毒负链基因组RNA，并与P蛋白、L蛋白一起，形成病毒复制小体[15]。

因此，我们推测hnRNPA1出核后，迁移至病毒复制小体，参与病毒的复制。

为了证实以上推测，我们在293T细胞中共表达Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、Flag-M蛋白和H A-h n R N P A1，或者p C M V-F l a g载体和HA-hnRNPA1。

24 h后裂解细胞，以Anti-Flag亲和凝胶进行免疫共沉淀，再利用HA抗体进行Western blot，检测HA-hnRNPA1是否跟Flag标签的病毒蛋白共沉淀。

结果可知，在全细胞裂解液中，各个带Flag标签的病毒蛋白和带HA标签的hnRNPA1均成功表达；在免疫共沉淀的样品中，HA-hnRNPA1被Flag-NP和Flag-M共沉淀，但不能被Flag-P或者pCMV-Flag载体共沉淀，揭示hnRNPA1跟NP和M蛋白相互作用，跟P蛋白不存在相互作用（图2）。

Input
IP
图2 NDV NP和M蛋白与hnRNPA1相互作用
Fig.2 NDV NP and M interact with hnRNPA1
2.3 干扰hnRNPA1的表达不利于NDV的复制以上实验结果说明：NDV感染导致hnRNPA1出核，且hnRNPA1迁移至病毒复制小体，与病毒的NP、M蛋白相互作用。

但hnRNPA1在病毒的感染过程中，发挥了促进病毒增殖的作用还是抗病毒作用呢？我们在HeLa细胞中，转染sihnRNPA1干扰hnRNPA1的表达，以转染non-target control siRNA （NC）作为阴性对照。

转染siRNA 36 h之后，以1 MOI剂量的NDV感染细胞，12 h后收取细胞样品，以Western blot检测hnRNPA1的干扰效果和病毒蛋白的表达。

结果可知，与NC对照组相比较，sihnRNPA1成功地干扰了hnRNPA1的表达，并且，病毒蛋白NP的表达略有降低（图3A）。

进一步检测NDV NP mRNA发现，相较于NC组，干扰hnRNPA1的实验组NDV的mRNA水平显著降低（图3B）。

以上结果揭示hnRNPA1对病毒复制起着促进作用。

V
i
r
u
s
m
R
N
A
f
l
o
d
c
h
a
n
g
e1.5
1.0
0.5
0.0
A B
图3 siRNA干扰hnRNPA1的表达不利于NDV的复制Fig.3 siRNA knock down of hnRNPA1 does not support
NDV replication
A: 通过Western blot检测干扰hnRNP A1对NDV-NP蛋白表达的影响; B:通过RT-PCR检测干扰VCP时NDV-NP基因复制情况
（p<0.001）
A: sihnRNP A1 and using Western blot detect the expression of NDV-NP protein; B: sihnRNP A1 and using RT-PCR to detect the replication of NDV-NP gene (p<0.001)
2.4 外源表达hnRNPA1有利于NDV复制 在HeLa细胞转染HA-hnRNPA1质粒时，以另一组细胞转染pCMV-HA载体作为阴性对照。

转染24 h后，以1 MOI NDV感染，12 h收取细胞样品，Western blot 检测HA-hnRNPA1和病毒蛋白的表达。

结果可知，HA-hnRNPA1成功表达；与pCMV-HA转染组相比较，HA-hnRNPA1显著促进了病毒蛋白NP的表达。

进一步检测病毒mRNA发现，相较于pCMV-HA对照组，HA-hnRNPA1促进病毒mRNA的复制水平（图4B）。

本实验进一步证实了hnRNPA1对NDV复制增殖的促进作用。

3 讨论
在本研究中，我们发现NDV感染导致hnRNPA1出核，与病毒核衣壳蛋白NP共定位，并能结合NP，说明hnRNPA1可能迁移到病毒复制小体，参与病毒
· 11 ·
姜维雨等：NDV 感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖第29卷第5期的复制。

出乎意料的是，病毒M蛋白也与hnRNPA1有相互作用。

有报道表明，NDV M蛋白在感染早期进入细胞核，抑制宿主细胞RNA转录，有助于病毒RNA的复制和转录
[16]。

我们推测M蛋白进入细胞核
后，促进hnRNPA1出核进入细胞质，迁移至病毒复制小体，促进病毒基因组RNA的合成及mRNA的转录。

然而，hnRNPA1的出核机制尚不清楚，还需要进一步研究。

进一步实验证实，siRNA干扰hnRNPA1的表达，病毒RNA复制和蛋白表达有所下降，外源表达hnRNPA1，病毒RNA复制和蛋白表达均有所升高，说明hnRNPA1确实有助于病毒的复制增殖。

虽然干扰或过表达hnRNPA1对病毒的复制有影响，但幅度不大。

造成这一结果的原因，可能是由于转染效率的缘故：不是所有的细胞都能有效地转染hnRNPA1质粒或者siRNA，这一部分未转染的细胞，干扰了实验结果；另一个可能性是hnRNPA1对病毒复制起到辅助作用，但不是必需的。

以往关于hnRNPA1参与病毒复制的研究，多集中在冠状病毒、禽流感、甲病毒及肠道病毒
[13]。

在肠道病毒感染过程中，hnRNPA1通过改变病毒IRES（internal ribosome entry sites，IRES）的结构
以促进病毒复制；在辛德毕斯病毒感染过程中，
hnRNPA1通过促进病毒正链RNA和负链RNA的合成，帮助病毒复制；在冠状病毒科的非典型肺炎冠状病毒、鼠肝炎病毒及猪流行性腹泻病毒感染过程中，hnRNPA1与核衣壳蛋白N相互作用，促进病毒基因组复制。

以上研究说明，hnRNPA1对不同病毒复制的影响机制有所区别。

在本研究中，我们发现hnRNPA1与NDV核衣壳蛋白NP相互作用，促进病毒复制增殖，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究首次证实了hnRNPA1参与副粘病毒的复制。

鉴于hnRNPA1结合RNA的特性，推测此蛋白家族可能广泛性地参与RNA病毒的复制。

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V i r u s m R N A f l o d 1.52.01.00.50.0
A B
图4 外源表达hnRNPA1促进NDV 复制Fig.4 Overexpression of hnRNPA1 enhances NDV
replication
A: 通过Western blot 检测过表达hnRNP A1时NDV-NP 的表达情况; B: 通过RT-PCR 检测过表达hnRNP A1时NDV-NP 基因复制
情况（p <0.01）
Overexpressing hnRNP A1 and using Western blot to detect the expression of NDV-NP; B: Overexpressing hnRNP A1 and using RT-PCR to detect the expression of NDV-NP gene (p <0.01)
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