动物细胞培养技术研究的现状与思考

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第12卷 第11期 2010 年 11 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 12 No. 11 Nov .，2010
组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907年美国生物学家Harrison [1]
在无菌条件下，
以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。

这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。

特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。

然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。

因此，文章对国内外动物细胞培养技术相关的研究动态进行了系统地分析和思考，为相关研究者提供参考依据，同时也是本课题组对将要开展的参环毛蚓细胞培养体系研究进行必要的前期准备。

1 无脊椎动物细胞培养现状及应用
无脊椎动物包括多孔动物门、腔肠动物门、环节动物门、节肢动物门、软体动物门和棘皮动物门。

无脊椎动物的细胞培养研究起步晚于哺乳动物，由于无脊椎动物细胞在形态、结构和功能以及营养需求等方面的特殊性，其细胞培养多停留在原代培养和有限细胞系水平上[2-3]。

迄今为止没有建立起永生性的细胞系，但随着对某些低等无脊椎动物如海
绵的天然活性产物的开发，以及人工养殖虾贝类病
害防治等研究的需要，无脊椎动物细胞培养将会受到关注。

1.1 多孔动物门 多孔动物又称海绵动物（Spongia），主要代表有毛壶和浴海绵，是多细胞动物中最低等最原始的一类，只有细胞分化，没有真正
的组织。

1993年Klautau [4]
多次尝试了对海绵细胞的体外培养，因后来被鉴定是污染的原生动物细胞。

随后，许多学者进一步完善了海绵的细胞培养方法，并获得了海绵细胞的悬浮培养方法。

Rinkevich 等[5]将海绵胚胎细胞培养了41周，大大提高了体外培养海绵细胞的存活时间。

Richelle-Maurer 等[6]在对桶状海绵（Xestospongia muta）的培养中发现，体外培养的海绵细胞具有自发的聚集能力，形成类似于成体海绵皮层细胞的网状结构。

自1998年Custodio 等[7]
首次建立了海绵的细胞团培养法以来，由于海绵特殊的细胞结构和生理特点，使得海绵细胞培养成活仍然存在诸多困难，其进展缓慢，目前仍旧停留在原代培养的水平上。

1.2 腔肠动物门 腔肠动物门包括珊瑚、海葵和水螅等，是真正的二胚层多细胞后生动物，有了组织的分化，但结构简单，体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结构的中胶层构成，细胞类型少。

有许多研究者进行了腔肠动物组织细胞的分离和培养，但只有Frank 等[8]成功地得到了10种腔肠动物的长期培养物，细胞于体外培养7~20天后开始增
动物细胞培养技术研究的现状与思考
侯雪芹，林小桦，李 薇
（广州中医药大学，广东 广州 510006）
摘 要：细胞培养是生物医学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验
学等多个领域。

文章主要对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的分析，并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问题以及未来的发展方向。

为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据。

关键词：动物细胞培养；细胞系；组织培养技术
中图分类号：R965.2 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2010) 11- 0037- 03
收稿日期：2010-06-10
基金项目：国家自然科学基金项目（30772741）；广东省科技计划项目（2007B020701004）作者简介：侯雪芹（1985-），女，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：新技术在中药品质研究中的应用。

通讯作者：李薇（1957-），女，湖北武汉人，教授，研究方向：中药品种鉴定和品质评价。

E-mail：liwei-li@。

Animal Cell Culture Technology Research Status and Thinking
HOU Xue-qin，LIN Xiao-hua，LI Wei
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China）
Abstract：
Cell culture is an important technology in biomedicine. It is widely used and has penetrated into cryobiology，biochemistry，clinical laboratory science and other fields. This paper makes detailed analysis on the application and progresses of invertebrate and vertebrate cell culture. On this basis，some problems of animal cell culture and the future direction of development are discussed. It provides theoretical reference for researchers to establish other types of cell lines and to screen for a suitable method of cell line culture in related areas.
Key words：Animal cell culture；cell line；tissue culture
辽宁中医药大学学报12卷
殖，并能传代几次。

随后的大量研究主要集中在腔肠动物的细胞分离技术和培养基质两个方面。

研究表明，多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活[9]，而且它们只有附着于由中胶层残片（mesoglea pieces）构成的基质上，才能很好地贴壁、铺展和迁移[10]。

因此，寻找和制备可以替代腔肠动物中胶层的培养基质是保证今后腔肠动物细胞体外培养的关键技术问题。

1.3环节动物门 环节动物分为3个纲：多毛纲（沙蚕）、寡毛纲（蚯蚓）和蛭纲（水蛭），环节动物身体出现分节，具真体腔，是比较高等的无脊椎动物。

目前尚未见有沙蚕细胞培养的成功报道，仅见水蛭的神经细胞培养，但仅停留在原代培养阶段。

关于蚯蚓体外培养的研究，近年来只有Battaglia和Davolin[11]报道了对蚯蚓（Eisenia foetida）体外培养条件的研究结果，成功得到了可以在体外存活1天以上的蚯蚓细胞培养物，该培养物中含有3种不同类型的细胞，但是没有观察到细胞增殖的现象。

其中一种悬浮生长的直径在20μm左右的培养细胞，在形态学上与蚯蚓的体腔细胞很相似。

总体而言，环节动物的细胞培养工作多年来未发现有重大突破性进展。

1.4软体动物门 软体动物门包括各种螺类、双壳类、乌贼和章鱼等。

由于软体动物细胞培养有着广泛的应用前景，所以对其研究开展相对于其他无脊椎动物也较早较广泛。

最先是Benex（1967）对贻贝（Mytilus edulis）的组织进行了培养研究。

而后，Machii[12]（1974）进行了珍珠贝（Pinctada fucata martensii）外套膜组织培养。

1976年，Hansen等[13]建立起了第一个也是迄今为止唯一一个软体动物细胞系：淡水蜗牛（Bromphalaria glabrat）胚胎细胞系BGE。

但是在建立海洋软体动物细胞系方面，目前尚无类似的成功报道。

另外，1979年，Brewster和Nicholson等[14]成功地将牡蛎（Concha Ostreae）的变形细胞在体外培养了6个月。

尽管如此，软体动物细胞培养并不顺利。

到目前为止，除了BGE细胞系，还没有成功建系的报道。

原代培养的细胞一般不能分裂，不能形成单层，也许是其中的一个原因。

软体动物细胞培养主要应用在免疫学、神经生物学、环境检测、肿瘤生物学以及水产养殖珍珠生产等。

1.5节肢动物门 节肢动物可分为3个亚门7个纲，其中甲壳纲、蛛形纲、多足纲、昆虫纲的种类多，分布广，某些种类可供药用，主要代表虾、蟹、昆虫。

最早进行昆虫组织体外培养的是Richard Goldschmiedt（1915）[15]，他使用惜比古天蚕蛾（Hyalophora cecropia）的精子进行体外培养，用来观察精子的发育。

首次成功建立连续培养的昆虫细胞系的是Grace[16]，于1961年建立了桉蚕蛾（Anteraea eucalypti）卵巢细胞系（Grace，1962）。

从此，昆虫细胞系的建立工作在世界范围内广泛展开，新建立的细胞系（株）不断出现。

到目前为止，全世界建立的昆虫细胞系有800株以上，分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8个目的170多种昆虫，其中大部分来自鳞翅目和双翅目，昆虫细胞系是很多生物学领域中非常重要的研究工具。

双翅目昆虫的细胞系，如蚊虫细胞系主要用来研究虫媒病毒、寄生虫等动物和人体的
病原体，果蝇细胞系[17]主要用于遗传学、发育生物学的研究；同翅目的叶蝉细胞系用来研究叶蝉传播的植物病毒病的病原；鳞翅目昆虫细胞系应用最为广泛，主要用于研究昆虫杆状病毒、微孢子等昆虫专性寄生物的侵染机制及其分子生物学，还被应用于大规模生产重组病毒杀虫剂，构建昆虫细胞—杆状病毒表达载体系统，表达具有研究或商品价值的外源蛋白质等。

甲壳纲动物以虾类细胞培养研究较多。

自1971年Peponnet和Quiot[18]首次报道虾鳖和美洲龙虾的类淋巴组织的培养以来，已开展了大量的虾类细胞培养工作。

目前，虾类的原代细胞培养已经成功，并且在虾类病毒的检测和疫苗制备中得到了成功的应用。

其中，我国学者童裳亮[19]在中国对虾（penaeus chinensis）的原代细胞培养上取得了可喜的研究成果，开发出了适合对虾生长的对虾专用培养基MPS，虽然还没有一个永生性细胞系建立起来，但是在培养方法和技术上已积累了许多经验。

1.6棘皮动物门 棘皮动物门包括海星、海胆、海参和海百合等均为底栖海洋动物，种类不多，具有中胚层起源的真骨、后口和发达的真体腔等比较高等的进化特征，向脊索动物进化中的无脊索动物。

棘皮动物的细胞培养研究开展得很少，虽然棘皮动物具很强生能力，但是其细胞培养还是难获成功，1996年Ermak和Odintsova[20]报道了贴壁因子对体外培养海胆胚胎细胞的生长和分化的影响，主要是对胚胎细胞的原代培养，至今棘皮动物的细胞培养仍停在原代培养的水平。

2 脊椎动物细胞培养现状及应用
脊椎动物从低级到高级分为：鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类，脊椎动物细胞培养研究开展得较早，细胞系构建较完善。

2.1鱼类 鱼类的细胞培养，始于20世纪60年代，由Wolf[21]和Quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼生殖腺细胞系RTG-2。

此后，鱼类的细胞培养研究进展十分迅速。

据Fryer等[22]统计，到1994年为止，至少已建立了159株鱼类细胞系。

其中，淡水鱼类和溯河洄游性鲑科鱼类的细胞系有125株，分别来源于21个科的52种鱼类的不同组织；而海水鱼类的细胞系仅有34株，分别来源于13个科的22种海水鱼类的不同组织。

我国对于鱼类细胞培养的研究始于20世纪70年代，迄今已建立了20多株细胞系。

目前，鱼类细胞培养技术已成为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学以及资源保护等方面。

鱼类培养细胞作为试验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：（1）成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气；（2）重复性好，实验条件可以精确控制。

因此，对鱼类细胞系进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都具有深远意义。

2.2两栖类动物 两栖类动物细胞培养研究相对哺乳类较少，目前发现有关国内资料[23]对中国林蛙的输卵管上皮细胞进行原代与传代培养，并对其形态及生长增殖能力等生物学特性进行鉴定研究，建立了林蛙的输卵管上皮细胞体外培养方法，为开发应用及保护中国林蛙的天然资源具有重要的现实意义。

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2.3爬行类动物 爬行动物相对于哺乳动物来说，比较低等，属于变温动物。

但是相对于更为低等的其它脊椎动物如两栖动物、鱼类来说，它又是真正的陆生动物，完全脱离了水对它的限制。

因此，我们在进行细胞培养的时候，必须考虑爬行动物的特殊生活环境，特别是温度和渗透压。

目前有关国内资料[24]首次探索了成体壁虎脊髓细胞的原代和传代培养，并对其部分细胞进行了鉴定。

2.4鸟类 鸟类动物细胞培养其历史最早可追溯到19世纪末，据可考证的资料记载，Wilhelm Roux[25]是第一个进行鸟类动物组织培养实验的人，他于1885 年将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天。

随后，外科医生出身的卡雷尔用血浆包埋组织加鸡胚汁培养鸡胚心肌组织，证明了离体的动物组织在人工环境中具有近乎永久的生长和繁殖能力。

由于在鸟类动物细胞培养中以鸡的胚胎细胞培养研究较多，可供培养的细胞种类广泛，加之胚体与成体所处生存环境不同，随着很多学者在改进培养操作技术方法、培养组织的器皿和培养基等方面做的工作，使得胚胎组织细胞的培养进入一个快速发展的阶段。

同时，鸡的体外胚胎培养，也为发育生物学、胚胎学、畸胎学、免疫学、遗传学、病毒学等研究提供了行之有效的实验手段。

2.5哺乳类动物 哺乳类动物细胞培养研究较多，起步时间较早，其生物学特性更接近于人体天然产物，特别是对人体的免疫性远低于原核等其它系列的同类产品，成为目前生物技术产品研发的重点。

对那些只有在哺乳动物细胞中才能获得有效表达及用于人体的基因药物的研发而言，哺乳动物细胞培养占有更重要的地位。

20世纪80年代初期，在世界卫生组织（WHO）明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，该领域的细胞培养在生物技术药物的研发中获得了长足发展。

据目前统计，已批准上市的生物技术药物中，70%是由哺乳动物细胞生产的。

特别是哺乳动物的克隆应用其前景是十分可观的，主要表现在：（1）扩大优良畜种或稀有动物的数量；（2）利用克隆的转基因动物，对细胞和组织进行替代疗法；（3）引用克隆技术作为辅助生殖手段，使不孕不育者得到自己的后代等。

3 存在问题及展望
近一个世纪以来，人类对动物细胞培养技术的大量研究和开发，并取得了一定的进展。

但目前的技术水平还远不能满足细胞生物制品开发和生产的要求。

目前存在的问题主要有：①各类动物细胞培养技术水平发展不均衡，特别是低等动物类细胞培养的技术和方法尚不成熟。

②动物细胞培养效率较低，其成活率和利用率也不理想。

③在大规模、长时间的人工培养过程中，细胞群体的生理机能受到影响，如分泌和代谢能力的丧失或代谢产物的活性降低等。

④动物细胞培养所用的培养设备以及培养用微载体等耗材昂贵，造成研究和开发的成本增加，这也成为限制动物细胞培养工程在中国大规模的开展的重要原因之一。

尽管存在着各种各样的困难，但并不能阻止人们对开发利用动物细胞的追求。

随着分子生物学研究范围不断地拓宽和研究水平不断地提高，动物细胞培养技术仍将继续成为多个学科研究的重要工具。

越来越多的动物细胞也将会成为重要的生物实验材料和工业化生产利用的基础。

◆
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