双水相萃取技术

双⽔相萃取技术
双⽔相萃取技术
（two-aqueous phase extraction）
⼀、前⾔
近年来，随着基因⼯程、蛋⽩质⼯程、细胞培养⼯程、代谢⼯程等⾼新⽣物技术研究⼯作的⼴泛展开，各种⾼附加值的⽣化新产品不断涌现，对⽣化分离技术也提出了越来越⾼的要求。

与上游过程相⽐，⽬前作为下游过程的⽣化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了⽣物技术的⼯业化发展。

因此，就迫切需要⼀种分离步骤少，收得率⾼，处理时间短，并且易于放⼤的⽣化分离纯化技术，双⽔相萃取技术就满⾜了这⼀需要。

特别是基因⼯程技术的发展，需要从细胞中提取⾼质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在⼤量的轻质细胞碎⽚，给遗传物质的提取形成了很⼤的⼲扰，通常通过离⼼分离和溶剂萃取难以得到⾼纯度⾼活性的遗传物质，⽽通过双⽔相初步提取，可以使⽬标物和轻质碎⽚得到很好的分离，且⽬标物的活性⼏乎没有损失。

因此双⽔相萃取技术得到了很⼤的重视，并且在近20年⾥取得了较⼤的发展。

⼆、发展史
双⽔相萃取技术⼜称之为⽔溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）
1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）――――体系的发现
2、1956年瑞典伦得（Luhd）⼤学的Albertson发现双⽔相萃取技术可⽤于蛋⽩质的选择分离，但⽬标蛋⽩同成相⾼聚物的分离是影响了其⼤规模⼯业应⽤。

――――――――――发现可以⽤于分离提纯
3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等⼈⾸先将双⽔相技术应⽤于从细胞匀浆液中提取酶和蛋⽩质，从⽽⼤⼤改善了胞内酶的提取过程，提⾼了酶的收得率。

―――――――利⽤于活性物质的提取
4、1989年，Diamond等⼈以Flory－Huggins理论为基础，推导出⽣物分⼦在双⽔相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。

――――――――――开始理论研究
5、20世纪90年代以来，由于控制和优化技术的发展，将⽣化分离过程进⾏集成化（process integration）和将⽣化反应与分离过程集成化成为了研究热点。

――――――――――集成化研究
三、与传统分离⽅法的⽐较
在⽣物发酵产品制备中，细胞和细胞碎⽚的除去是整个分离纯化的第⼀步，也是最为关键的⼀步，它将直接影响到后续⼯序的收得率。

传统的分离⽅法主要采⽤离⼼法及过滤法。

这两种⽅法在实际应⽤中都有⼀定缺点，如离⼼法能耗⾼，
过滤法膜孔容易堵塞。

⽽双⽔相萃取，整个操作可以连续化，除去细胞和细胞碎⽚的同时，还可以起到纯化⽬标物的作⽤。

各种⽅法的⽐较见表A，可以看得出，在除去细胞碎⽚的各种⽅法中，双⽔相萃取技术是传统的离⼼分离和过滤法⽆法⽐拟的。

和传统的酶粗分离⽅法，如盐析，有机溶剂沉淀相⽐，双⽔相萃取分离技术也有很⼤的优势。

见表B，⼀般说来，传统的分离⽅法达到与双⽔相萃取相同的处理量时，需要⽐双⽔相萃取多3到10倍的设备，⽽且⽐双⽔相萃取分离⽅法放⼤困难。

虽然双⽔相萃取技术具有很⼤的优势，但⽬前真正⼯业化的例⼦却很少。

主要原因是⼤规模分离时，双⽔相萃取的成本较⾼，使得其技术上的优势⼤打折扣。

⼤规模分离中，双⽔相萃取总成本中主要是原料成本（90％以上）。

原料成本和⽣产规模成正⽐，因⽽随着⽣产规模的放⼤，总成本也增加很⼤。

⽽传统的分离⽅法中，总成本主要是设备投资，并且设备投资并不与⽣产规模成正⽐。

因⽽是的⼤规模⽣产时双⽔相萃取技术没有优势可⾔。

因此降低成相物的成本是双⽔相萃取技术⼯业化应⽤的关键。

四、双⽔相体系的构成
1、双⽔相体系的形成
A、⾼聚物/⾼聚物体系
作为⼀种体系，也就是说它是⼀个系统，在⽆外界⼲扰的情况下，系统的能量总要趋向于最低状态。

对于双⽔相体系⽬前主要有两种解释法：⼀种认为两种聚合物相互混合时，究竟是否分层还是混成⼀相，主要取决于两种因素，即分⼦间作⽤⼒和熵的增加。

两种物质混和时熵的增加与涉及的分⼦数⽬有关，同分⼦⼤⼩⽆关。

但分⼦间的作⽤⼒，可以看作分⼦中各个基团之间相互作⽤⼒的总和，分⼦越⼤当然作⽤⼒就越⼤。

可见对于⼤分⼦⽽⾔决定混合的结果主要取决于分⼦间的作⽤⼒，⽽不是熵增。

若两种聚合物分⼦间若表现为排斥⼒，即某种分⼦希望在它的周围的分⼦系同种分⼦⽽⾮异种分⼦，则达到平衡后，就有
可能分成两相。

若存在引⼒，或同种分⼦引⼒或异种分⼦斥⼒不够强，则会混容或很难形成两相。

另外⼀种就简单的归结为分⼦间的空间位阻，即在⼀定条件下，由于⾼聚物分⼦的空间阻碍作⽤，⽆法互相渗透形成均相，具有相互分离倾向⽽形成两项系统。

若从混合前后能量的⾼低来解释就更好理解。

假设有两种物质，物质A要进⼊物质B的体系中，⾸先要克服它本⾝分⼦间的作⽤⼒，假设所需能量为E1，然后需要B克服的空间位阻，即B物质要分开留出⼀定空间来容纳物质A，假设所需能量为E2，混合后，AB物质相互作⽤，假设释放的能量为E，如果E1+E2>E，则表现为不相容，分为两相；若E1+E2
B、⾼聚物/⽆机盐系统
⾼聚物和⽆机盐形成两相系统⽐较⼀致的解释是盐析作⽤。

C、⽣化分离常见的体系
聚⼄⼆醇（poly ethylene glycol PEG）/葡聚糖（Dextran DEX）系统
PEG/DEX硫酸盐系统
PEG/硫酸盐系统
PEG/磷酸盐系统
实验证明这两种聚合物对⽣化活性物质⽆毒害作⽤，反⽽起到保护作⽤，使分⼦结构更稳定。

2、相图（作图说明）
A、双节线TCB将单相区和两相区分开，曲线下⽅是由两种⾼聚物混合溶液组成的均相体系，曲线上⽅是由两种⾼聚物溶液组成的双⽔相体系。

B、直线TMB称之为系线，系线上的所有点构成的双⽔相体系的组成相同，但体积⽐不同。

C、T和B点分别代表上下相两种⾼聚物的质量百分组成。

D、由于上下两相密度差别不⼤，则有V T/V B=BM/TM
E、C点表⽰系线长度为零，代表两相差别消失或者说两相即将形成的点，称之为临界点（critical point）或褶点（plait point）
F、双节线的位置和形状与聚合物的分⼦量有关。

聚合物的分⼦量越⾼，相分离所需的浓度越低；两种聚合物分⼦量的差别越⼤，双节线的形状越不对称。

见图①B
五、双⽔相萃取分配理论基础
双⽔相萃取与⽔-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同（⼀个两相都是⽔溶液，⽽另⼀个⼀相是⽔溶液，另⼀相是有机溶液）。

当物质进⼊双⽔相体系后，由于表⾯性质、电荷作⽤和各种⼒（如疏⽔键、氢键和离⼦键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中分配的浓度不同。

分配系数Ｋ等于物质在两相的浓度⽐，即K＝C1/C2。

（C1⼀般表⽰上相，C2⼀般表⽰下相）因为各种物质的Ｋ值不同，可利⽤双⽔相体系对物质进⾏分离提纯。

1、表⾯⾃由能的影响
众所周知，当体系达到平衡时，分⼦处于某⼀相时若能量低，则它会⽐较集中地分配到该相中。

设分⼦⾃相2移到相1所需能量为△E，则根据相平衡时，化学位应相等的原则，可得到分配系数K应为：
式中：k—波尔茨曼常数；
T—温度。

设某种被分离物质的分⼦表⾯积为A，
则在两相中的表⾯能分别是Aγ
1
和Aγ
2,可得:
kT
e
C
C
K
E
2
1
-
=
=
kT
e
C
C
k
)
-A(
2
1
2
1
γ
γ-
=
=
分析上式可知分配系数主要取决于分⼦的表⾯积和表⾯性质
(1)、当分⼦在两相中的表⾯性质相同时，可知K ＝1，则这种物质在两相中的分配相同，这种系统不能将该物质提纯浓缩。

（2）、当分⼦在两相中的表⾯性质不相同时，则K ≠1，若差别越⼤，K 值就会越⼩或是越⼤，即C 1和C 2的差值就越⼤，就更有利于该物质的提纯浓缩。

（3）、从表⾯积来说，A 值越⼤，会导致C 1和C 2的差值就越⼤。

⼀般来说，分⼦量和表⾯积成正⽐，所以从理论上来说，利⽤双⽔相系统分离⼤分⼦物质是很合理的。

（4）、另外，对于⼀个待分离的混合溶液来说，由于各种物质分⼦的表⾯积
不同，且在两相中的表⾯性质也存在差异，所以其分配系数K 值也不会⼀样，从⽽在双⽔相体系中能达到提纯的作⽤。

2、表⾯电荷的影响
对于带电物质的正负粒⼦，当在两相中分配系数K 不相等时，就会产⽣电位差，称之为道南电位（Donnan potentin ）
当两相分配达到平衡时，经推导得到如下式⼦：
可见可以通过加⼊带电粒⼦来改变两相的电位差，从⽽影响物质在两相中的的分配系数。

六、影响分配的因素
1、聚合物的分⼦量
根据表⾯⾃由能的理论，
我们知道可以通过改变表⾯张⼒的⼤⼩来改变分⼦的分配系数。

⽐如⽤PEG/DEX 系统提取蛋⽩质，如果想让蛋⽩质分配在上相，则要求K 增⼤，蛋⽩质表⾯积A 不变，从⽽要求γ1―γ减⼩2，也就是说要降低蛋⽩质在上
相（主要含有PEG ）的表⾯张⼒，提⾼在下相（主要含有DEX ）的表⾯张⼒。

⽽表⾯张⼒的⼤⼩同聚合物分⼦量⼤⼩有关，分⼦量越⼤，其端基数⽬减少，导致疏⽔性增加，从⽽使表⾯张⼒增⼤。

因此需要降低PEG 的分⼦量，增⼤DEX 的分⼦量。

当聚合物的分⼦量降低时，蛋⽩质易于分配富含该聚合物的相中，这是⼀条普遍规律，不论何种成相聚合物系统，何种进⾏分配的⽣物⾼分⼦都实⽤。

2、聚合物浓度的影响
(1)、当聚合物处于双节线以下时，被分离物将均匀分布于溶液中。

（2）、当超过双节线，则形成两相，此时随着聚合物或盐浓度的不同变化，双⽔相系统的性质将发⽣较⼤的变化。

因此可以通过改变聚合物或盐的浓度来改变物质在系统的分配系数。

⼀般说来，当系统远离临界点时，系统的表⾯张⼒将+--++=-Z A
Z B K K F Z Z RT U U ln )(12kT e C C k )
-A (2121γγ-==kT e C C k )
-A (2
121γγ-==
增加。

（画相图解释）
3、盐类的影响
由于各种⽆机离⼦在PEG/DEX分配系数的不同，当加⼊⽆机盐后，将在两相间形成不同的电位差，这对带电⽣物⼤分⼦的分配产⽣很⼤的影响。

见表①C
例如：NaCl对卵蛋⽩和溶菌酶分配系数的影响，
（作曲线图解释，见图①C）
另外，HPO
4
2－离⼦在PEG/DEX系统中的分配系数很⼩，因⽽加⼊PH⼤于7的磷酸盐缓冲溶液能很⽅便地改变相间电位差，使带负电的⽣物⼤分⼦移向PEG 相。

4、pH值的影响
影响所分离分⼦的离解度，导致分⼦所带电荷的性质的改变，从⽽改变了这种分⼦在两相中的分配系数。

影响磷酸盐的离解度，若改变HPO
42－和H
2
PO
4
－之间的⽐例，使相间电位发
⽣变化，从⽽影响分配系数。

当研究某种分⼦的分配系数与PH的关系时，如加⼊不同的盐，则将形成不同的电位差，那么pH与K的关系也会不同。

但在等电点时，得到的是不带电荷的分⼦的分配系数，对于不同的盐类应有相同的K值，因⽽在不同的盐系统中，分配系数与PH的关系曲线的交点即为等电点。

这种测定等电点的⽅法称之为交错分配（cross partitioning），⽐如研究⾎清清蛋⽩在两种盐中的pH与K的关系（作图说明）①D
5、温度影响
温度主要是影响溶液的粘度，温度⾝⾼有利于相分离时间缩短，但影响不⼤。

我们知道⾼温度对活性⼤分⼦有破坏作⽤，⽽聚合物对⽣物分⼦有保护作⽤，所以⼤规模⽣产中⼀般采⽤常温操作，不会引起损失。

这样可以节约操作费⽤。

七、双⽔相萃取技术的应⽤
⽬前在国外双⽔相体系萃取分离技术主要应⽤于菌体、细胞、细胞器和亲⽔性⽣物⼤分⼦的分离、纯化。

近⼏年，在亲⽔性⽣物⼩分⼦物质的分离、提纯应⽤⽅⾯也已开始进⾏了研究。

应⽤的范围主要包括：
(1)、细胞组织的分离，如⽤三甲胺PEG/DEX体系可分离含胆碱受体的细胞，分配系数Ｋ=3.64，回收率可达57%。

(2)、酶的分离、提纯，如⽤PEG/DEX体系分离过氧化氢酶，Ｋ＝2.95，回收率Ｙ=81 %。

(3)、病毒的纯化，如⽤PEG/NaDS体系可对脊髓病毒和线病毒进⾏纯化，回收率可达90 %。

(4)、核酸的分离，如⽤PEG/DEX体系可分离有活性核酸DNA。

(5)、⽣长激素的纯化，如⽤PEG/盐体系可提纯⼈的⽣长激素，分配系数Ｋ＝6.4，回收率Ｙ＝60 %。

(6)、⼲扰素的分离，⽤PEG－磷酸酯/盐体系分离β－⼲扰素，Ｋ＝630，Ｙ=97%。

⽤该体系可从重组⼤肠杆菌匀浆中提取α－⼲扰素，Ｋ＝1 55，Ｙ=99.5%，纯度提⾼2 5倍。

(7)、⽣物⼩分⼦物质的分离，关怡新等⼈以填料塔为萃取设备，⽤PEG/(NH4)2SO4体系对青霉素G钠盐在其中的传质性能进⾏的研究表明，双⽔相
体系萃取分离技术对⽣物⼩分⼦物质的分离也是可以取得理想效果的。

(8)、药物的分离和提纯，如基因⼯程药物、抗菌素、动、植物药物的提取。

也可以利⽤该技术开发我国传统的中草药。

(9)、在分析检测中的应⽤，例如可以⽤PEG（4000）/MgSO4体系对强⼼药物异羟基⽑地黄毒苷进⾏免疫测定，⽤
PEG（6000）/磷酸钾体系结合循环伏安法可建⽴⼀种双⽔相体系检测螺旋霉素的电化学⽅法。

1、传统典型的酶提取和提纯
双⽔相萃取开始主要应⽤于胞内酶的提取，应⽤这种⽅法，⾸先应满⾜下列条件：
A、欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；
B、酶的分配系数⾜够⼤，经过⼀次萃取，就能得到⾼的收率；
C、两相⽤离⼼分离很容易。

由于⼤规模分离时，原料成本较⾼（总成本的90％），所以⼀般采⽤成本较低的PEG/盐系统，典型的流程图（作图解释）
分配在上相中的蛋⽩质可通过加⼊适量的盐（有时也可同时加⼊少量的PEG）。

进⾏第⼆次两⽔相萃取。

通常第⼆步萃取的⽬的是除去核酸和多糖，它们的亲⽔性较强，因⽽易分配在盐相中，则蛋⽩质就留在PEG相中。

在第三步萃取中，应使蛋⽩质分配在盐相（例如，调节PH值）。

使其和主体PEG分离。

⾊素由于其疏⽔性强，通常分配在上相。

主体PEG可以循环使⽤，⽽盐相蛋⽩质可⽤超滤法去除残余的PEG以提⾼产品纯度。

注意：单位重量的相系统中均浆液的加⼊量是⼀个重要参数。

从经济上来说，总是希望多加⼊。

但加⼊过多会影响聚合物的成相体系，改变相体积⽐和分配系数，反⽽使收得率降低。

⼀般来说，1千克相系统处理200～400克湿菌体为宜。

2、⽬前双⽔相萃取技术应⽤研究热点
从⽣化分离技术的研究发展趋势来看，⽬前已经实现了观念上的转变，即由过去的局部改进的思路转化成了从全局的⾼度来看待问题。

⼀般认为⽣化分离技术的开发可以从两个⽅⾯着⼿：其⼀，继续研制⼀些适⽤于⽣化⼯程的新型分离技术，如近年来研究⽐较多的亲和分离法、逆胶束法、液膜法、各类⾼效层析法、双⽔相分配技术及超临界流体萃取等；其⼆，进⾏各种分离技术的集成化。

根据
这⼀思路这⾥介绍⼀下双⽔相分配技术与相关分离技术(如电泳、层析、温度诱导相分离、渗透释放和亲和技术等)的集成化过程。

A、与温度诱导相分离集成
与其他常⽤的⽣化分离技术相⽐，由于成相聚合物的成本等因素，双⽔相分配技术在经济上缺乏优势，⼀定程度上限制了其规模化应⽤。

如何使成相聚合物得以有效地循环利⽤⼀直受到普遍关注，加⼊盐形成PEG/盐系统或超滤分离等⼀般⽅法均⽆法迅速有效地回收聚合物。

温度诱导相分离技术的引⼊为解决聚合物回收问题开辟了⼀条成功的新路⼦。

此类聚合物通常不带电，它在⽔溶液中的可溶性主要是由于与⽔分⼦形成氢键。

温度的提⾼有利于它得疏⽔作⽤，使聚合物相互聚集，发⽣沉淀。

这类聚合物通常有临界温度（LCST），在临界温度以上，氢键作⽤已不⾜以维持聚合物分⼦的可溶性，从⽽产⽣沉淀。

当温度降低低于临界温度时，聚合物有可逆溶解。

因此在双⽔相分离中，我们可以通过改变温度，使富含⽬标物的聚合物沉淀下来，达到⽬标物和昂贵得聚合物得分离，使聚合物能够快速得重复利⽤。

可见这种⽅法即简单⼜节约了成本。

虽然我们常⽤得PEG也是⼀种温敏聚合物，但它的临界温度太⾼（100℃以上），不可能⽤于⽣物活性⼤分⼦得分离。

在过去得⼗⼏年中找到了许多新型的，临界温度⼤⼤降低得温敏型聚合物，如聚N－异丙基丙稀酰胺、聚N－⼄烯基⼰内酰胺或两者得共聚物、甲基纤维素、聚⼄烯甲醚、⼄基－羟⼄基纤维素等。

氧化⼄烯和氧化丙烯的共聚物（简称EOPO，m（EO）：m（PO）＝1：1，相对分⼦质量在4000左右），在0.2mol/L的硫酸钠溶液中的临界温度为40℃。

这种聚合物与DEX或羟丙基淀粉可以形成双⽔相体系。

将含有3－磷酸葡聚糖酶的酵母匀浆液加⼊到此双⽔相体系中，⽬标酶转移到聚合物上相，残渣以及其它蛋⽩质转移到葡聚糖和羟丙基淀粉组成的下相。

将上相移出，加热到40℃，⼜形成新的两相体系：上相是含有酶的⽔相，下相的聚合物质量百分⽐可达到40％，冷却稀释后可供下次使⽤。

这个过程3－磷酸葡聚糖酶的纯化因⼦为3～5，收率为60％～80％。

纯化因⼦（purification factor）：定义和⽐活有关，⽐活的定义是每克物质中所含活性产品的重量或单位数，⽽经过纯化后的⽐活与纯化前之⽐称之为纯化因⼦。

Johhansson在EOPO分⼦上引⼊⼀个疏⽔基团，形成⼀种新的聚合物（HM —EOPO），它的临界温度⼤⼤降低（12℃左右），⽤来从⼈⾎浆和⼤肠杆菌发酵液中纯化阿朴脂蛋⽩，发现酶的活性收率接近100％，表明此系统操作条件温和，不会造成酶的失活。

Presson也对它进⾏了研究，表明阿朴脂蛋⽩的纯化因⼦可达到5.5，收率为78％。

B、同亲和沉淀的集成
双⽔相分配具有易于直接处理含细胞碎⽚等固体颗粒的优点，亲和沉淀则由于引⼊特异性的亲和作⽤使得分离效率明显提⾼，⼆者相互结合实现集成化，可充分发挥双⽅的优势，实现优势互补，⼀⽅⾯使双⽔相亲和沉淀技术能直接处理含固体颗粒物料，另⼀⽅⾯⼜提⾼了双⽔相分配的纯化因⼦，同时解决了亲和配基与⽬标物和成相组分的分离问题。

Kamihira等⼈将亲和沉淀与双⽔相分配技术相结合来纯化重组蛋⽩质Ａ。

亲和沉淀载体为⼀种可逆溶解的聚合物(Eudragit S100)，⽤⼈免疫球蛋⽩G（Ig）为配基。

因Eudragit主要分配在上相，故蛋⽩质Ａ与Eudragit S100－IgG络合⽽萃⼊上相，分出上相，调节pH值使Eudragit 沉淀，再⽤洗脱液洗脱可得蛋⽩质Ａ，同时上相及载体－配基复合物可循环使⽤。

Dong等⼈利⽤这⼀技术从肌⾁匀浆液中提取LDH，过程集成之后，既能发挥双⽔相分配去除细胞碎⽚的优点，并促使⽬标蛋⽩质分配在上相，经亲和沉淀后⼜可使⽬标物能与原系统中的成相组分分离，这⼀新的分离过程更显⽰出⾼效和节能的优势。

C、磁场增强双⽔相分离技术
双聚合物双⽔相系统由于同提取物混合后粘度⼤、相密度差⼩，相分离时间⼀般需要10～30min。

Flygare等⼈通过在相系统中添加铁氧颗粒(即磁铁矿，直径约1µm，添加量约10～50mg/ml)，利⽤磁场作⽤来加速相分离，双⽔相系统中铁氧颗粒分配于下相，在磁场作⽤下铁氧颗粒定向移动，带动了包含有铁氧颗粒的下相⼩液滴聚集成相，从⽽缩短了相分离时间。

对PEG/PES系统相分离时间可缩短到原所需时间的1/100，对PEG/磷酸盐系统也可缩短为1/10，⼀般可在1min内完成相分离，并可克服因细胞匀浆的加⼊引起的相分离时间的增⼤。

实验表明，铁氧颗粒的加⼊并不影响酶的分配系数，有⼈⽤3.3cm x 30cm的分离柱进⾏了实验室规模的分离，从酵母细胞中亲和提取磷酸果糖激酶、⼄醇脱氢酶等，结果表明磁场加强相分离是切实可⾏的。

D、与⽣物反应的集成
⽣物转化过程⼀般都存在着⼀定程度的产物抑制，且对于规模化⽣产还有细胞或酶的循环利⽤问题。

⽬前主要采⽤膜分离和固定化技术，但对某些特殊底物(如⽊质纤维素)，如果采⽤固定化技术则底物的转化率很低，⽽膜分离技术⼜难以操作。

将双⽔相分配与⽣物转化相结合，形成双⽔相⽣物转化，为解决这⼀问题提供了新的思路。

双⽔相系统对菌体或酶通常没有毒性，选择适当的分离条件，可以使菌体细胞或酶分配在下相，⽽转化产物分配于上相，这样转化过程中由于产物被萃取⼊上相⽽消除
了产物抑制作⽤，同时分布于下相的细胞或酶得以循环使⽤(作图说明，见②)很明显，将双⽔相分配与⽣物转化相结合，同时解决了产物抑制和⽣物催化剂回收利⽤两⽅⾯的问题，为⽣物转化赋予了新的内涵。

Tjerneld等⼈利⽤双⽔相⽣物转化，将⽊质纤维素经过酶⽔解⽣产⼄醇，效果很好。

Bartlett等⼈实现了在双⽔相系统中α-⽢露糖苷酶催化糖基转化合成低聚糖。

Andersson等⼈研究了PEG/DEX系统中利⽤枯草杆菌进⾏流化发酵⽣产α－淀粉酶，⽐普通发酵的酶产率提⾼了63%。

他们还将这⼀技术应⽤到青霉素酰化酶的⽣产中。

另外还有胞内释放和双⽔相分离的耦合、电泳技术与双⽔相分离的集成、与超声波技术的集成、与⽓溶胶技术的集成、与层析分离技术的集成等等。

七、双⽔相萃取技术展望
(1)、廉价可成相聚合物的开发
我们知道影响双⽔相技术⼤规模⼯业应⽤的主要因素就是成相聚合物的价格太⾼，⼯业应⽤同其它技术没有优势可⾔。

如果降低了聚合物的成本，则它的优势就可以显⽰出来。

科研⼈员也在这⼀⽅⾯做了许多⼯作。

Krone（1981）⾸先利⽤粗DEX取代DEX，Folke（1987）⽤变性淀粉PPT取代DEX，David（1988）⽤麦芽糊精取代DEX，Alka（1989）利⽤阿拉伯树胶取代DEX，Skuse（1992）利⽤羟丙基纤维素取代PEG都获得了⼀定的成功。

再加上新功能聚合物的开发，⽐如温敏性聚合物，这样可以⼤⼤降低聚合物的成本。

（2）、集成技术技术的应⽤
我们知道，有相分离时间长的缺点，与温度诱导相分离、磁场作⽤、超声波作⽤、⽓溶胶技术等实现集成化，可以改善了分相时间长的问题，为双⽔相分配技术的进⼀步成熟、完善并⾛向⼯业化奠定了基础。

双⽔相萃取界⾯张⼒⼩(10-7～10-4ｍＮ/ｍ)，有助于强化相际间的质量传递。

但是，较⼩的界⾯张⼒会导致乳化现象的产⽣，使相分离时间延长，分离效率不⾼。

另外，双⽔相体系的粘度较⾼，造成了⽣物转化过程的氧传递速率降低，这也在⼀定程度上限制双⽔相技术同⽣化发酵反应相结合的应⽤。

这也可以通过对温度诱导相分离、磁场作⽤、超声波作⽤、⽓溶胶技术集成化得进⼀步研究来得到解决。