ABO血型基因型检测实验步骤

ABO血型基因型检测实验
【实验材料】
pBR322/Msp I Marker；ABO基因复合PCR扩增产物。

【实验准备】
1. 器材：电泳仪、垂直板电泳槽系统、脱色摇床、涡旋混合仪等；
2. 试剂：生工PCR试剂盒、引物由生工合成、NEB内切酶AluI和KpnI-HF、DNA加样缓冲液(6×)、10×TBE电泳缓冲液(贮存液)、40%丙烯酰胺预混液(Acr-Bis 液，19∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、10%(M/V)过硫酸铵(APS)、GeneGreen核酸染料等；
2.1 染色液：用0.1g AgNO3定溶于100mL超纯水中，现配现用；
2.2 显色液：1.2g NaOH，400μL 37%甲醛溶液定容于100mL预冷的超纯水中，现配现用；
2.3 固定液：10%冰乙酸，10mL冰乙酸定容于100mL超纯水中。

【实验步骤】
一、ABO血型基因多重PCR扩增技术
多重PCR反应混合体系配制(表1、表2)：在冰上放置0.2mL PCR管，根据总体积(50μL)加入无菌ddH2O，将PCR试剂解冻后置于冰上操作，可按体积由大到小顺序依次加入相关成分，配制反应混合体系；
表1 多重PCR引物
引物序列碱基数浓度预计产物
1：5'-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3' 20bp 5μM200bp (A和B等位基因)
2：5'-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3' 20bp 5μM199bp (O等位基因)
3：5'-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3' 21bp 5μM
159bp (A、B和O等位基因) 4：5'-CACCGACCCCCCGAAGAA-3' 18bp 5μM
表2 多重PCR混合体系(50μL)
组别DNA模板10×buffer MgCl2dNTPs 引物1 引物2 引物3引物4Taq酶ddH2O 实验组5μL5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL26.7μL 对照组—5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL31.7μL 终浓度20~500ng 1× 1.5mM 0.2mM 0.2μM0.2μM0.1μM0.1μM 1.5U —将配制好的混合液轻轻混匀并轻微离心，在PCR扩增仪上按下表编入程序(表3)：
表3 PCR程序设定
参数预变性变性退火延伸延伸保存
温度95℃95℃60℃72℃72℃4℃
时间2min 30s 30s 30s 3min 备用
循环数 1 30 1 ∞
编完反应程序后，置PCR管于PCR扩增仪反应孔中，开动机器。

二、DNA大小测定
1. 采用
2.5%琼脂糖凝胶电泳检测：ABO血型基因PCR扩增产物；
2. 测量Marker和目的DNA所显色出电泳条带的迁移距离；
三、双酶切反应
1. 使用限制性内切酶AluI和KpnI-HF对复合PCR产物同时消化，37℃温育5~15分钟，反应体系参考表4，试剂具体用量可根据实际需要调整；
表4 双酶切反应体系
体系PCR产物10×CutSmart Buffer AluI KpnI-HF ddH2O 总体积
反应体系40µL5µL 1µL 1µL 3µL 50µL
2. 酶切反应预期结果：如表5所示；
2.1 O基因经过KpnI-HF酶切后为171bp和28bp，故171bp片段出现则说明有O基因；
2.2 B基因经过AluI酶切后产生118bp和41bp，所以118bp片段出现说明有B基因。

表5 ABO基因型谱带
基因型引物1和2 KpnI-HF消化引物3和4 AluI消化酶切形式可见片段(bp) 酶切形式可见片段(bp)
AB 无酶切200 半酶切159，118 OO 完全酶切171 无酶切159 BB 无酶切200 完全酶切118 BO 半酶切200，171 半酶切159，118 AA 无酶切200 无酶切159 AO 半酶切200，171 无酶切159
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳
1. 渗漏检查：按仪器说明制备胶室，吸取适量超纯水或双蒸水添加至胶室，静止3~5min，仔细检查胶室是否渗漏(渗漏须拆卸重新制备)，将胶室中水倒出，剩余水分可用滤纸条吸干；
2. 凝胶配制(本实验浓度为6%)：依所分离的DNA片段大小来确定合适的凝胶的浓度，用于核酸电泳检测的PAG其交联度(C%)一般为19∶1，所需40% Acr-Bis 液体积为V a (mL)=凝胶总体积V (mL)×胶浓度(T%)÷40% (表6)；本实验30%(19∶1) Acr-Bis液也可以用；
表6 不同浓度PAG试剂表
试剂
不同浓度(T%)凝胶(100mL)
3.5 5.0 8.0 12.0 20.0
Acr-Bis液8.75mL 12.5mL 20mL 30mL 50mL
10×TBE 10.0mL 10.0mL 10.0mL 10.0mL 10.0mL
去离子水添加至100mL
TEMED 35μL35μL35μL35μL35μL
10%过硫酸铵0.7mL 0.7mL 0.7mL 0.7mL 0.7mL
3. 凝胶灌制：用微量移液器将溶液从玻璃板的凹处向两玻璃板之间慢慢倒入，注意避免在凝胶中产生气泡，直到灌满为止，将梳子插入凝胶中，待凝胶聚合成固体后，小心拔出梳子，用电缓冲液冲洗样品孔；
4. 添加缓冲液：在上样槽中加满1×TBE电泳缓冲液，仔细观察槽中的电泳缓冲液是否渗漏，否则须将胶板拆卸重新安装，确保其中缓冲液不渗漏；然后在电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液，液面高度约为电泳槽高度的1/3~1/2；
5. 加样：25μL双酶切产物分别与5μL加样缓冲液充分混合，用微量移液器小心快速的加入到上样孔中；
6. 电泳：接通电源(通常以1~8V/cm的电压进行电泳)，电泳至标准参照染料迁移至所需位置，切断电源，拔出导线，弃去槽内的电泳缓冲液；
7. 取胶：卸下玻璃板，用专用取胶板小心撬去上面的玻璃板，检查凝胶是否完好地附在下面的玻璃板上，将上面的玻璃平稳的拿开，小心剥离并取出凝胶；
8. 银染：将凝胶放入装有超纯水的瓷盘中，用超纯水漂洗2次；转入染色液中，避光摇床银染10min，用超纯水清洗1min，重复清洗一次；转入显色液中，看到条带后立即终止显影，用固定液固定后观察；
说明：
由于银染灵敏度较高，5μL pBR322/Msp I Marker中的DNA含量相对较高，因
此可吸取1μL Marker、4μL水与1μL加样缓冲液充分混合后再加样。

聚丙烯酰胺凝胶浓度越高或环境温度越高，则凝固速度越快；当环境温度较低时，按表配制较低浓度(如低于8%)凝胶时，可采用水浴锅温育凝胶液(如45~50℃)，从而加快凝胶凝固速度；。