肥胖大鼠PGC-1αmRNA表达变化及糖皮质激素对其的影响

肥胖大鼠PGC-1αmRNA表达变化及糖皮质激素对其的影响
中 文 摘 要
第一部分 肥胖大鼠模型的建立和血糖、血脂及胰岛素敏感性变化 目的：建立贴近临床的营养性肥胖大鼠模型，观察肥胖大鼠的形态、血糖、血脂及胰岛素敏感性变化情况。

方法：应用普通饲料(能量352kcal/100g)和高脂饲料(能量493kcal/100g)分别饲养成年大鼠80天，观测大鼠体重、体长及Lee’s指数，普通饲料大鼠设为对照组，从高脂饲料大鼠中进一步筛选出肥胖大鼠，并设为实验组，再观测空腹血糖、血脂、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗程度的变化。

结果：应用高脂饲料喂养后，普通饲料组大鼠体重、体长、Lee’s指数与高脂饲料组差异比较均有统计学意义(P<0.001)，实验组大鼠的空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、胰岛素水平及胰岛素抵抗程度均明显高于对照组(P<0.01～P<0.001)，而高密度脂蛋白明显低于对照组(P<0.001)。

.结论：高脂饲料可以使成年大鼠发生营养性肥胖，肥胖可引起糖脂代谢紊乱，高胰岛素血症及胰岛素抵抗。

关键词：肥胖；大鼠；高脂饲料；Lee’s指数；血糖；血脂；胰岛素抵抗
第二部分 肥胖大鼠PGC-1αmRNA表达变化及糖皮质激素对其的影响 目的：研究肥胖大鼠棕色脂肪和骨骼肌中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptor-gamma coactivator-1α, PGC-1α)mRNA表达变化及糖皮质激素对普通大鼠和肥胖大鼠生理生化指标及PGC-1αmRNA表达的影响。

方法：高脂饲料构建肥胖大鼠模型，向肥胖大鼠和普通大鼠腹腔分别注射生理盐水及不同剂量的琥珀酸氢化可的松，观察其摄食、体重、空腹血糖、血脂、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗程度的变化，用实时荧光定量PCR方法，检测大鼠棕色脂肪和骨骼肌中PGC-1αmRNA的表达水平。

结果：肥胖大鼠的棕色脂肪和骨骼肌中PGC-1αmRNA的表达水平明显低于普通大鼠；糖皮质激素注射后大鼠体重减轻，高剂量糖皮质激素组尤为显著，糖皮质激素注射的第2天肥胖大鼠即有体重减轻，普通大鼠则在第5天开始有体重减轻，这种体重减轻持续到实验结束；糖皮质激素注射后大鼠摄食减少，进一步分析发现，肥胖大鼠逐日累积摄食量在高剂量糖皮质激素注射后第10天与生理盐水组比较即有显著减少，普通大鼠自第16天开始有显著性差异，这种摄食量减少持续到实验结束；
连续20天用高剂量糖皮质激素可使普通大鼠和肥胖大鼠的血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、胰岛素水平及胰岛素抵抗程度较生理盐水组显著升高(P<0.05～P<0.001)，高密度脂蛋白显著降低(P<0.001)；应用高剂量糖皮质激素后普通大鼠和肥胖大鼠的棕色脂肪和骨骼肌中PGC-1αmRNA的表达水平明显低于对照组。

结论：肥胖大鼠的PGC-1αmRNA表达下降；应用糖皮质激素使大鼠摄食减少，体重减轻，出现明显的糖脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，PGC-1αmRNA的表达与应用剂量和时间相关，高剂量糖皮质激素抑制大鼠PGC-1αmRNA的表达，PGC-1α可能在能量代谢中起重要作用。

关键词：肥胖；PGC-1α；糖皮质激素；大鼠；体重；摄食
Changes of the expression levels of PGC-1αmRNA in obese rats and the effects of glucocorticoid
Abstract
Part 1 The obese animal model induced by high-fat diet and changes
of glucolipid and insulin sensitivity
Objective: To establish adult alimentary obese rats models and observe their changes in appearance, serum levels of glucose, lipid, and sensitivity of insulin. Methods: The adult rats were fed with normal food(total energy content was 352kcal/100g) and high fat food(total energy content was 493kcal/100g )for 80 days respectively and their weight, length, and Lee’s index were observed, the rats which fed with normal food as control, then selected the obses rats from the rats which fed with high fat food, the serum levels fasting blood glucose, lipid, insulin and the degree of insulin resistance were observed. Results: The weight, length, Lee’s index had significant difference between the high fat food group and the normal food group(P<0.001), fat rats had higher serum levels of fasting blood glucose, triglyceride, total cholesterol, low-density lipoprotein, insulin and the degree of insulin resistance, but lower high-desity lipoprotein than the control(P<0.01～P<0.001). Conclusions: High fat food may cause alimentary obesity in adult rats, obesity can cause glucolipid metabolism disorders, hyperinsulinemia and insulin resistance.
Keywords: obesity; rat; high-fat food; Lee’s index; glucose; lipid; insulin resistance Part 2 Changes of the expression levels of PGC-1αmRNA in obese rats and the effects of glucocorticoid
Objective: To study the changes of brown adipose tissue and skeletal muscle peroxisome proliferators-activated receptor-gamma coactivator-1α(PGC-1α)mRNA expression in obese rats, the effects of glucocorticoid on the physiologcal and biochemical index and the expression levels of PGC-1αmRNA in normal rats and obese rats. Methods: Get obese rat models induced by high-fat diet, both normal and obese rats were intraperitoneal injected with normal saline and different doses of hydrocortisone succinate respectively. The changes of food intake,weight, serum levels of fasting blood glucose, lipid, insulin and the degree of insulin resistance were observed,real-time fluorescent quantitative PCR method was used to examine the expression levels of PGC-1αmRNA in brown adipose tissue and skeletal muscle of rats.
Results:. The expression levels of PGC-1αmRNA in brown adipose tissue and skeletal muscle of obese rats were lower than those of the normal ones significantly. Rats have weight loss after glucocorticoid injection,especially in high dose group,the weight loss began from the 2nd day of obese rats and the 5th day of normal ones since the injection,which lasted till the end. The appetite were suppressed by glucocorticoid, moreover, obese rats injected with high dose glucocorticoid had less accumulative food intake than the normal saline injected since the 10th day, and so did normal ones since the 16th da y, which lasted till the end. Injection of high dose glucocorticoid for 20 days can induce rats, both normal rats and obese ones, to have higher levels of fasting blood glucose,triglyeride, total cholesterol, low-density lipoprotein, insulin and the degree of insulin resistance(P<0.05～P<0.001), and lower high-density lipoprotein (P<0.001)than those injected only with normal saline.The expression levels of PGC-1αmRNA in brown adipose tissue and skeletal muscle, both in normal and obese rats, were lower than those in the control significantly, after high dose glucocorticoid injection. Conclusions: The expression levels of PGC-1αmRNA are decreased in obese rats. After glucocorticoid injection, food intake and weight gain are decreased, the disorder of glucose, lipid metabolism and insulin resistance are induced.PGC-1αmRNA expression may be correlated with doses and times, high dose glucocorticoid inhibits the PGC-1αmRNA expression. PGC-1α may plays a key role in energy metabolism.
Keywords: obesity; PGC-1α; glucocorticoid; rats; weight; food intake
前言
当今，肥胖及肥胖相关性疾病已逐渐成为世界性健康问题之一，当体内能量摄入大于能量消耗导致能量过剩时形成肥胖。

腹型肥胖者常有较严重的代谢紊乱，如胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，高胰岛素血症、糖耐量异常、脂代谢紊乱、高血压、高尿酸血症、高血凝低纤溶、微量白蛋白尿、C反应蛋白上升等，且表现为聚集现象，人们称之为胰岛素抵抗综合征或代谢综合征(metabolic syndrome，MS)。

MS患者发生2型糖尿病、动脉粥样硬化性心脏病，癌症，非酒精性脂肪肝等疾病的危险性明显增加，这已严重危害了人类的身心健康。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)，是近几年来发现的一种核转录辅激活因子，最早是Puigserver利用酵母双杂交技术从小鼠的棕色脂肪组织构建的cDNA库中发现的[1]，因其能辅激活核受体过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)而命名的，此后2个相关的辅激活因子PGC-1β和PGC-1相关辅激活因子(PGC-1-related coactivator, PRC)也被发现[2,3]，三者组成PGC-1家族。

人PGC-1α基因位于染色体4p15.1，含798个氨基酸，分子量为91kD[4]，而大鼠的PGC-1α基因位于染色体14q11，含796个氨基酸，分子量为92kD，氨基酸序列与人类有95%的一致性[5]。

PGC-1α在骨骼肌、棕色脂肪组织、心脏、肝及肾等组织中均有较高水平的表达，而在白色脂肪组织、胰腺及脑组织中则较少或几乎没有表达[4,6]，在寒冷环境中、禁食或空腹时、运动及给予瘦素后均可使PGC-1α的表达增加[1,7-11]，而胰岛素则抑制PGC-1α的表达[12]。

PGC-1α能与转录因子或其它辅激活因子相互作用通过不同机制增加靶基因转录效率，从而在机体的适应性产热、线粒体生物合成、肝糖异生及脂肪酸β氧化等一系列能量代谢过程中发挥作用，与IR、肥胖及2型糖尿病关系密切，已引起人们的关注，成为肥胖、糖尿病等代谢性疾病发生及治疗的新热点。

本实验利用高脂饲料饲养成年大鼠，构建一种贴近临床的营养性肥胖大鼠模型，观察肥胖大鼠的生理生化指标变化，为进一步研究高脂饮食导致营养性肥胖并伴有糖脂代谢紊乱的病理生理机制提供理论基础，同时初步探讨PGC-1α在肥胖发生中的作用。

糖皮质激素可通过外周和中枢来影响身体的能量代谢平衡，皮质醇升高可以增加体脂含量[13]，临床上长期应用糖皮质激素的病人，出现糖脂代谢紊乱，向心
型肥胖，总体脂含量增加，食欲增加，体重增加，但有实验[14]却发现糖皮质激素使大鼠体重减轻摄食减少。

PGC-1α一方面能在多种组织的能量代谢途径转录调控中起重要作用，影响能量平衡；另一方面，与糖皮质激素一样，也可以和糖皮质激素受体结合，因此，糖皮质激素是否通过改变PGC-1α的表达而影响能量代谢平衡值得探讨。

本实验利用不同剂量糖皮质激素干预大鼠，观察大鼠糖脂代谢及胰岛素敏感性的变化，初步探讨糖皮质激素对大鼠PGC-1α表达的影响，为进一步研究糖皮质激素诱发糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗及对能量代谢的影响提供实验基础和理论依据。

第一部分
肥胖大鼠模型的建立和血糖、血脂及胰岛素敏感性变化
材料与方法
一主要试剂及实验动物
1.胰岛素放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所）
2.SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：
SCXK(沪)2003-0003）
二主要仪器设备
1.全自动生化仪(OLYMPUS A V2700)
2.低温高速离心机(Beckman)
3.γ放射免疫计数仪(XH-6020)
4.电子秤DS-671(上海市寺冈电子有限公司检验分度值1g)
5.普通卷尺(检验分度值0.5cm)，
三研究方法
1.饲养健康雄性清洁级SD大鼠125只，体重180～200g，放入清洁房间，
室温18～22ºC，自然光照，适应性喂养1周后随机分笼分组，每笼≤5只，普通饮食组38只，高脂饮食组87只，两组均饮用自配饲养用水(pH2.5～2.8)，普通饮食组饲以基础饲料，高脂饮食组饲以高脂饲料，均自由进饮及进食量。

基础饲料配方：水分9.2%，粗蛋白22.1%，粗脂肪5.28%，粗灰分5.20%，粗纤维4.12%，无氮浸出物52.0%，钙1.24%，磷0.92%，钙：磷1.35，赖氨酸1.34%，蛋氨酸+胱氨酸0.72%，能量352kcal/100g。

参考文献[15]制订高脂饲料配方：猪油 20%，白砂糖 4%，全脂奶粉(伊利牌) 2%，胆固醇 1%，胆酸盐0.5%，基础饲料 73%，能量493kcal/100g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司加工，放在-20～4ºC保存。

饲养80天后高脂饮食组大鼠满足：①体重>普通饮食组平均体重+1.5倍标准差；②Lee’s指数>普通饮食组平均Lee’s指数+1.5倍标准差者界定为肥胖大鼠，共得40只肥胖大鼠作为实验组，剩余高脂饮食大鼠淘汰，普通饮食组大鼠定为普通大鼠，并设为对照组。

2.一般情况每日观察大鼠精神、活动、皮毛、眼睛、食欲、大便。

3.体重、体长电子秤称体重，卷尺量体长(鼻尖至肛门的长度)，每周称量一次并记录。

4.Lee’s指数[16] Lee’s指数＝[体重(g)／体长(cm)]1/3× 10
5.血糖、血脂检测取血前至少禁饮禁食8h，并在清晨7～9时间断尾取血(尽可能避免溶血)，室温静置0.5h后，3000r／min离心20min，分离血清，当日采用全自动生化仪检测血糖、血脂。

6.胰岛素检测胰岛素放射免疫试剂盒购于北京北方生物技术研究所，采用γ放射免疫计数仪检测空腹胰岛素水平，实验按照说明书要求在专门实验室技术员指导下完成。

实验步骤见表1
表1 加样程序表(单位：μl)
(
HOMA-IR)指数评价外周胰岛素的抵抗程度 HOMA-IR = (空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5[17]
8.统计方法数值型变量以平均值±标准差(x±s)表示，进行方差齐性检测，两组间比较采用t(或t’)检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，由SPSS(10.0)统计软件包进行统计分析，以P<0.05为有显著性意义。

结果
一一般情况
两组大鼠均精神较好，活动无明显差异，初始时高脂饮食组大鼠大便较稀软，量偏多，且臭味重，随实验进行，除臭味仍重外，余观察指标渐如普通饮食组，但毛色渐偏黄，光泽度稍差。

二大鼠食欲及热量摄入(表2)
普通饮食组大鼠每只每日平均进食量(28.52±2.80)g较高脂组(24.40±2.51)g多4.12g (t=-7.87,P<0.01)，但是计算其平均热量摄入时发现高脂组大鼠平均每只每日摄入热量为(120.28±12.40)kcal，较普通饮食组(100.37±9.86)kcal高19.91kcal (t=9.64, P<0.01)，表明高脂饲料饲养的大鼠摄入热量增多，其体重增加与进食高热量食物有关。

表2大鼠平均摄食量、平均热卡摄入量比较(x±s)
分组n 平均摄食量(g/d•鼠) 平均热卡摄入量(kcal/d•鼠)
普通饮食组38 28.52±2.80 100.37±9.86
高脂饮食组87 24.40±2.51★★120.28±12.40★★
与普通饮食组比较，★ P<0.05，★★ P<0.01。

三饲养前后大鼠体重、体长和Lee’s 指数的变化(表3)
饲养前，普通饮食组大鼠体重与高脂饮食组相比差异没有统计学意义(t=-0.06,P>0.05)，但是饲养80天后高脂饮食组大鼠的平均体重为(657.83±64.23)g，比普通饮食组(570.92±68.16)g高86.91g，差异有统计学意义(t=-6.47,P<0.01)。

进一步比较普通饮食组、高脂饮食组大鼠饲养前后的体重变化发现，普通饮食组大鼠平均体重增加了(358.95±65.42)g，高脂饮食组大鼠平均体重增加了(441.84±60.27)g，两者比较差异有统计学意义(t=-6.74,P<0.01)。

饲养前，普通饮食组大鼠的体长、Lee’s指数与高脂饮食组相比差异均没有统计学意义(t分别为-1.89和0.98, P均>0.05)，饲养80天后高脂饮食组大鼠的体长(28.00±1.01)cm和Lee’s指数(28.62±0.82)均高于普通饮食组(27.00±1.16)cm和(27.61±0.96)，分别高出1.00cm和1.01，并有统计学意义(t分别为-4.19和-5.78，P 均<0.01)。

进一步比较两组大鼠饲养前后体长及Lee’s指数的变化，发现普通饮食组体长增加了(7.50±1.20)cm，高脂饮食组体长增加了(8.23±1.18)cm，普通饮食组Lee’s指数增加了5.40±0.85，高脂饮食组Lee’s指数增加了6.43±0.75，统计学检
验发现两组大鼠体长及Lee’s指数的变化有显著性差异(t分别为-3.17和-6.56，P均<0.01)。

表3两组大鼠饲养前后体重、体长和Lee’s 指数的变化(x±s)
指数
分组n 体重(g) 体长(cm) Lee’s
饲养前
普通饮食组38 215.39±10.94 19.57±0.52 22.24±0.36
高脂饮食组87 215.99±8.99 19.77±0.53 22.18±0.31
饲养后(d±s d)
普通饮食组38 358.95±65.42 7.50±1.20 5.40±0.85
高脂饮食组87 441.84±60.27★★8.23±1.18★★ 6.43±0.75★★
与普通饮食组比较，★ P<0.05，★★ P<0.01。

四肥胖大鼠空腹血糖、血脂、胰岛素水平及HOMA-IR的变化(表4) 分析发现，饲养前作为对照组的普通饮食组大鼠和作为实验组的高脂饮食组中的肥胖大鼠之间的空腹血糖(blood glucose, BG)、甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TCH)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、胰岛素(insulin, INS)水平及HOMA-IR差异没有统计学意义(t分别为0.59，-0.65，-0.77，0.76，0.08，1.08和0.69，P均>0.05)，饲养80天后实验组大鼠的BG(5.50±0.73)mmol/L、TG(1.42±0.48)mmol/L、TCH(2.47±0.30)mmol/L、LDL(0.81±0.17)mmol/L、INS(30.10±4.31)μIU/ml及HOMA-IR(7.35±1.34)均高于对照组大鼠的BG(4.99±0.87)mmol/L、TG(1.13±0.70) mmol/L、TCH(2.20±0.29)mmol/L、LDL(0.35±0.09)mmol/L、INS(19.74±2.29) μIU/ml 及HOMA-IR(4.33±0.65)，分别高出0.51mmol/L、0.29 mmol/L、0.27mmol/L、0.46 mmol/L、10.36μIU/ml、3.02，而实验组大鼠的HDL(1.31±0.16)mmol/L较对照组大鼠的HDL (1.59±0.23)mmol/L低0.28mmol/L，差异均有统计学意义(t分别-2.80,-2.12， -4.05, -14.96，-13.15，-12.49和 6.24，P均<0.01)。

饲养80天，实验组的BG增加值(0.86±0.82)mmol/L、TG增加值(0.61±0.34)mmol/L、TCH增加值(0.47±0.15)mmol/L、LDL增加值(0.63±0.11)mmol/L、HDL降低值(0.60±0.13)mmol/L、INS增加值(9.47±4.07) μIU/ml 及HOMA-IR增加值(3.08±1.24)均高于对照组大鼠的BG增加值(0.20±0.37)mmol/L、TG增加值(0.35±0.52)mmol/L、TCH增加值(0.26±0.15)mmol/L、LDL增加值
(0.16±0.08)mmol/L、HDL降低值(0.27±0.35)mmol/L、INS增加值(0.46±0.96) μIU/ml 及HOMA-IR增加值(0.29±0.26)，t分别为-4.58、-2.57、-6.56、-21.49、5.34、13.62及13.91，P除TG比较为<0.01外均<0.001。

表4大鼠血糖、血脂、胰岛素及HOMA-IR的变化(x±s)
分组n BG
(mmol/L)
TCH
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL
(mmol/L)
LDL
(mmol/L)
INS
(μIU/ml)
HOMA-IR
饲养前
对照组38 4.79±0.94 1.95±0.32 0.78±0.23 1.91±0.31 0.20±0.06 19.99±2.50 4.19±0.66 实验组40 4.65±1.24 2.00±0.27 0.81±0.16 1.90±0.25 0.19±0.09 20.63±2.74 4.27±1.29 饲养后(d±s d)
对照组38 0.20±0.37 0.26±0.15 0.35±0.52 0.27±0.35 0.16±0.08 0.46±0.96 0.29±0.26 实验组40 0.86±0.82★★★0.47±0.15★★★0.47±0.15★★0.60±0.13★★★0.63±0.11★★★9.47±4.07★★★ 3.08±1.24★★★与对照组比较，★ P<0.05，★★ P<0.01，★★★P<0.001
注：BG：血糖，TCH：总胆固醇，LDL：低密度脂蛋白，HDL：高密度脂蛋白，TG：甘油三酯，INS：胰岛
素
讨论
目前营养和能量代谢研究中常用的肥胖动物模型有遗传性肥胖动物模型，食物、谷氨酸钠及金硫葡萄糖所诱导的肥胖动物模型，其中遗传性肥胖动物模型是通过改变基因型产生的，一般有研究基因功能等特殊用途，而谷氨酸钠所致的肥胖动物模型是向新生小鼠或大鼠皮下注射谷氨酸钠，结节漏斗处多巴胺系统受损，致使内分泌及其他功能低下，而发生代谢性失调[16]，金硫葡萄糖所致肥胖动物模型是向成年小鼠腹腔注射金硫葡萄糖导致其腹侧正中核受损[18,19]，动物过度摄食发生肥胖。

食物诱导肥胖动物模型的必需条件之一就是提供的热量必须超过当时机体所需的热量[20]。

本实验构造肥胖大鼠模型是为了类比人类肥胖个体，因此选用食物诱导肥胖动物模型，希望实验结果更具有临床应用意义。

在利用食物制造肥胖动物模型的许多研究中，由于没有注意选择合适的动物[21]，致使模型质量欠佳，影响研究结果。

众所周知，动物也有其自身的生长规律，以SD大鼠为例，其寿命平均为2.5年，幼年期为0-6周，如果自其幼年起即给予高脂饲养制造肥胖模型，由于其生长发育，动物的骨骼、肌肉、内脏的增长较快，体重的增加中脂肪含量的增加所占比重较低，因此利用体重小于150g的大鼠制造饮食诱导的肥胖模型常常会影响肥胖模型的质量进而影响研究的可信性。

本实验选择了7周龄体重在180～200g的大鼠高脂饲料饲养诱导制造肥胖模型，避免了假阳性模型，使研究结果更真实可靠。

本实验中应用一种含猪油20%、糖4%和胆固醇1%的高脂饲料配方，热卡为493kcal/100g，较基础饲料的热卡352kcal/100g高141kcal/100g。

结果显示，高营养饮食诱导的肥胖大鼠TCH、TG均较正常组显著升高，这是由于饲料中猪油的添加致大鼠胆固醇、饱和脂肪酸摄人增加，使肝脏胆固醇、甘油三酯合成增加。

此外，大鼠因进食高营养饲料而体重增加显著，亦可使全身的胆固醇合成增加[22]。

同时，还发现随着大鼠体重的增加，大鼠血清TG含量也增加，提示TG 代谢异常在血脂紊乱和肥胖发生中具有重要意义。

用高脂饲料饲养的SD大鼠在80天造模结束时平均体重、体长及Lee’s指数均高于普通饮食饲养组并有统计学意义。

目前，关于研究肥胖的动物实验很多，但是，却没有衡量动物肥胖的统一标准。

用于衡量人体肥胖的体重指数，对于大鼠并不适用，大鼠肥胖标准除体重外，Lee’s指数也能较敏感地反映大鼠肥胖的变化[23]。

因此，我们采用大鼠体重和Lee’s指数，双重指标来衡量大鼠的肥胖程度，利用体
重大于普通饮食组平均体重+1.5倍标准差和Lee’s指数大于普通饮食组平均Lee’s指数+1.5倍标准差的双重标准界定肥胖，体重能较好地反映肥胖程度，Lee’s指数又能较好地反映肥胖的变化。

87只高脂饮食组中有40只达到要求，成模率为46%，与文献[24]介绍的成模率相当，证明本实验中采用的高脂饲料诱导肥胖大鼠模型是成功的。

肥胖大鼠的BG、TG、TCH、LDL和HDL与普通大鼠有明显差异，其幅度分别为+10%、+26%、+12%、+130%和-18%，变化幅度表明高脂饮食致使大鼠肥胖后，其血脂异常程度远较血糖异常程度高，并且血脂各成分的变化并不一致，水平升高的成分中以LDL升高幅度为著(130%)，其次是TG(26%)和TCH(12%)。

而潘玲[25]等利用高脂高糖饲料饲养大鼠致肥胖研究表明饲养8周后TCH升高幅度最大，为61%，其次为TG和LDL，升高幅度分别为43%和22%，HDL下降的幅度为18%，这种肥胖大鼠模型血脂水平的不同一性可能主要源自饲养食物中糖脂比例，这提示在制造食物诱导的肥胖动物模型时，应根据研究需要有目的的选择饲养用食物。

由于LDL在体内主要作用是将胆固醇从肝内运转到肝外组织，在动脉粥样硬化形成中起重要作用，其水平升高与心血管疾病患病率和病死率升高有关，HDL 主要是将肝外组织细胞中的胆固醇转运出来，然后被肝脏分解代谢，其水平升高有利于促进外周组织（包括动脉壁）移除胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的发生，本实验从LDL和HDL水平两方面支持目前高脂饮食诱发动脉粥样硬化的观点。

本次实验中，给于高脂饲料后导致大鼠肥胖并伴有BG、INS及HOMA-IR的升高，这说明高脂饮食可导致肥胖并伴有高胰岛素血症及IR，与国内外文献报道相似[15,26]，而体内胰岛素水平升高进一步加重肥胖，造成恶性循环。

高脂饮食能直接降低胰岛素刺激下骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的吸收作用同时提高肝糖的生成，致使血糖升高，因此摄入高脂饮食会改变对胰岛素敏感组织的葡萄糖的转变规律，从而导致整个机体糖代谢的紊乱[27]。

也有报道[28]证明高脂饮食改变了脂肪酸的组分，从而能够独立影响胰岛素的活性，改变胰岛素的敏感性。

肥胖伴有高胰岛素血症及IR的机制复杂，目前尚未完全阐明。

有研究之一，肥胖及胰岛素敏感性下降与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)有关，认为TNF-α可能是发生IR的调节因子。

肥胖时分泌TNF-α增多，TNF-α能直接抑制脂肪细胞上胰岛素受体和胰岛素受体底物-1酪氨酸磷酸化，从而影响胰岛素受体数量和活性[29]；加速脂肪分解，导致体内游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平增高，高FFA通过葡
萄糖脂肪酸循环导致IR[30]；通过抑制葡萄糖转运子4(glucose transporter 4, GLUT4)表达而抑制了胰岛素刺激的葡萄糖转运[31]。

因此，肥胖时过高表达的TNF-α通过直接和间接的作用引起并加重IR。

此外，我们还发现随着高脂饲料的饲养，大鼠毛色渐黄，光泽缺失，具体是由于高脂饲料中热量过高、营养不均衡导致大鼠营养不良，还是高脂饲料饲养后引起大鼠血糖血脂异常诱发的病理生理变化不详，但这种现象在肥胖模型的制造过程中鲜有提及，究竟是前人观察中未在意还是肥胖大鼠模型的差异所致有待于进一步的观察研究。

第二部分
肥胖大鼠PGC-1αmRNA表达变化及糖皮质激素对其的影响
材料与方法
一主要试剂和消耗材料
1.TRIzol (GIBCO/BRL)
2.Taq酶 (Qiagen)
3.TBE缓冲液 (Sangon)
4.氯仿、异丙醇、75%乙醇 (Sangon)
5.RT-PCR试剂盒 (Invitrogen)
6.SYBR Green Ⅰ荧光染料 (Qiagen)
7.HotStarTaq DNA聚合酶 (Qiagen)
8.琥珀酸氢化可的松(天津市生物化学制药厂，批号 20060314)
二主要仪器设备
1.PTC-225型高通量PCR仪(MJR)
2.UVP凝胶成像仪(Bio-Rad)
3.低温高速离心机(Eppendorf)
4.电泳仪(Bio-Rad)
5.DU-650型紫外分光光度计(Eppendorf)
6.Opticon实时荧光定量PCR仪(MJ Research)
三研究方法
1.动物及饲养
同第一部分
2.糖皮质激素处理
普通大鼠和肥胖大鼠分别随机分为生理盐水组(0.2ml/100g)、低剂量糖皮质激素组(琥珀酸氢化可的松5mg/kg)和高剂量糖皮质激素组(琥珀酸氢化可的松15mg/kg)，连续20天清晨8点(偏差≤10分钟)腹腔注射，所用溶液均于临用前配制。

3.观察指标
同第一部分
4.标本制备
血清标本制备同第一部分。

断颈处死大鼠后即刻留取两肩胛骨之间的棕色脂肪及腓肠肌，液氮速冻后-80℃保存备用。

5.血清学测定方法
同第一部分
6.总RNA的抽提和质量鉴定
采用TRIzol(GIBCO/BRL)试剂，该试剂是基于酸性酚一步抽提法产生的。

具体操作简述如下：
(1)将棕色脂肪组织约100mg迅速放入预先加入1mgTRIzol的匀浆器中，匀浆数
分钟，室温放置5min；
(2)将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入0.2ml氯仿于振荡器中振荡
15sec，静置5min后，4℃ 13000rmp离心15min分层；
(3)将上层水相转入另一无RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇上下颠倒数次，
静置10min后，4℃ 13000rmp离心15min沉淀RNA；
(4)倒去上清液，加入至少1ml75%的乙醇洗涤沉淀后，4℃ 13000rmp离心10min；
(5)倒去上清液，室温干燥5-10min，以无RNA酶的DEPC水溶解沉淀；
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(6)超低温(-80℃)冰箱保存备用。

(7)紫外分光光度计测定OD260/280比值并定量，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA
有无降解，观察28S︰18S亮度是否接近2，若比例降低则疑为降解，弃之。

(8)同法抽提并鉴定骨骼肌总RNA。

7.cDNA的合成
逆转录反应体系按Invitrogen公司的superscript RT kit
Ⅱ使用说明进行操作：20μl体系
RNA 1μg
Oligo(DT) 1μl
加RNAase-free ddH2O至11.5μl
混匀后，短暂离心
70℃孵育15min，置冰上冷休克2min，短暂离心后，加入
5×first stand buffer 4μl
0.1mDTT 2μl
dNTP 1μl
混匀，置42°C 2min后，加入
Superscript Ⅱ0.5μl
℃， -20℃保存
℃，70 15min
混匀，置42 60min
8.实时荧光定量PCR分析
(1)实时荧光定量PCR原理：
采用MJ Research公司Opticon实时荧光定量PCR仪。

SYBR Green Ⅰ是一种
结合到双链DNA的小沟部位并在激发光的激发下产生波长为490nm荧光的染料。

结合双链DNA后发出荧光，当荧光达到一定的域值时就会被仪器检测到，这时的
循环数称为Ct(threshold cycle)值，初始DNA量越多，荧光达到域值时所需要的
循环数越少，Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可
计算出样品中所含的模板量。

以管家基因β-actin或GAPDH 为内参，每孔设计一
个复孔，以校正每个样品的Ct值，使用前模板稀释10倍，SYBR Green Ⅰ染料原
液稀释500倍。

(2)用Primer Express2.0(ABI)软件设计反应引物(具体的引物名称及序列见表5)
要求满足：
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a长度：100-250个碱基
b Tm 值：58-60℃
c GC比例：45-55％
d引物二聚体连续配对不超过3个
(3)实时荧光定量PCR的反应体系：
cDNA 2ul
forward primer(10uM) 0.4ul
reverse primer(10uM) 0.4u1
Ⅰ 0.5ul SYBR Green dye
Hotstart Taq DNA聚合酶(5u/ul) 0.2ul
10×buffer 2.0ul
MgCl2(50mM) 1.2ul
dNTP Mix(10mM) 0.5ul
ddH2O 补足至总体积20 ul
总体积20 ul
并加阴性对照(不加模板cDNA)。