EMSA实验步骤

E M S A实验步骤(总3页)
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LightShift化学发光法EMSA试剂盒
试剂盒组成
化学发光法EMSA优化和质控试剂盒（20148×）
10×Binding Buffer，1ml，保存于-20°C
Biotin-EBNA Control DNA，50μl，保存于-20°C
Unlabeled EBNA DNA，50μl，保存于-20°C
Epstein-Barr Nuclear Antigen(EBNA) Extract，125μl，保存于-20°C Poly，125μl，保存于-20°C
50%Glycerol，500μl，保存于-20°C
1%NP-40，500μl，保存于-20°C
1M KCl，1ml，保存于-20°C
100mM Mgcl2，500μl，保存于-20°C
200mM EDTA，500μl，保存于-20°C
5×Loading Buffer，1ml，保存于-20°C
化学发光核酸检测模块（89880）
Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate，，保存于4°C Chemiluminescent Substrate，4°C可保存1年
Luminol/Enhancer Solution，80ml
Stable Peroxide Solution，80ml
Blocking Buffer，500ml，保存于4°C
4×Wash Buffer，500ml，保存于4°C
Substrate Equilibration Buffer，500ml，保存于4°C
EMSA步骤
A 配胶和预电泳
1 用×TBE配制非变性聚丙烯酰胺凝胶，大多数采用×TBE配制4-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶
2 用×TBE灌注电泳槽，直至刚好没过加样孔底部。

3 冲洗加样孔，100V预电泳30-60min
B 进行结合反应
1 融化所有结合反应成分，EBNA相关成分和待检测样品放在冰上，避免DNA 探针过热。

EBNA提取物加入前再融化。

2结合反应，根据Table 1，2，3准备20μl结合反应体系
Table 1
Table 2
Table 3
3 室温孵育20min
4 加入5μl 5×Loding Buffer，轻柔上下吹匀，不可剧烈混匀。

C 电泳
1 关闭电源
2 冲洗加样孔，每孔加样20μl
3 打开电源，100V电泳，溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳
D 转膜
1 将尼龙膜浸于×TBE，至少10min。

2 用冷却至10°C的×TBE和干净的海绵，镊子，手套进行转膜
3 100V，380mA转膜30-60min，
4 转膜结束后，将膜（带有溴酚蓝的一面）放在干纸巾上1min，使膜表面的缓冲液吸进膜内。

不能使膜变干。

立即进行步骤E
E 交联
用手持UV灯离膜处254nm照膜5-10min，将DNA与膜交联。

F 化学发光法检测生物素标记的DNA
1 37-50°C缓慢加温Blocking Buffer和4×Wash Buffer，直至颗粒完全溶解。

Substrate Equilibration Buffer在4°C和室温条件下使用。

2 用20ml Blocking Buffer封闭膜，轻柔摇床孵育15min
3 将μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至20ml Blocking Buffer中，配制Conjugate/ Blocking Buffer。

4 轻轻倒掉Blocking Buffer，换成Conjugate/ Blocking Buffer，轻柔摇床孵育15min
5 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中，配制1×Wash Buffer
6 将膜移入新容器内，用20ml 1×Wash Buffer短暂洗一次
7 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床多次洗膜，每次5min
8 将膜移入新容器内，加入30ml Substrate Equilibration Buffer，轻柔摇床孵育5min
9 将6ml Luminol/Enhancer Solution加至 6ml Stable Peroxide Solution中，配制Substrate Working Buffer，需避光。

10 将膜从Substrate Equilibration Buffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer。

将膜移入新容器内。

11 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面，不要摇动，孵育5min
12将膜从Substrate Working Buffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，但不要使膜变干。

13 用塑料包包住湿膜，避免气泡和起皱。

14 显影并拍照。