反基因锁核酸体内抑制HBV S基因的表达

反基因锁核酸体内抑制HBV S基因的表达
肖树荣;许桂丹;韦武均;彭彬;邓益斌
【摘要】目的目前针对乙型肝炎的治疗仍缺乏有效治疗手段,探讨反基因锁核酸在转基因小鼠体内抑制HBV S基因的表达和抗病毒效果. 方法采用随机数字表法将HBV转基因小鼠分为5组,每组6只,分别为空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组.空白组、无关序列组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组于第1、3、5d经尾静脉分别注射5%GLU-脂质体、5%GLU-脂质体-无关序列、5%GLU-脂质体-反义锁核酸、5%GLU-脂质体-反基因锁核酸各500 μL.拉米夫定组以2 mg/kg剂量每天灌胃2次,连续7 d.采用RT-PCR检测血清HBV DNA;酶联免疫法检测血清HBsAg;逆转录PCR检测肝HBV S mRNA水平;免疫组化检测肝细胞HBsAg水平;血清肝肾功能检查和组织细胞HE染色监测反基因锁核酸的毒副作用. 结果给药后第3、5、7天,反基因锁核酸组对HBV DNA复制的的平均抑制率分别为37.18%、50.27%和61.46%,第7天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05).给药后第3、5、7天,反基因锁核酸对HBsAg表达的平均抑制率分别为30.17%、44.00%和57.76%,第7天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05).与空白组、无关序列组、拉米夫定组和反义锁核酸组比较,反基因锁核酸更能抑制HBV S基因mRNA的表达(P<0.05).空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组阳性细胞率分别为93%、92%、78%、47%和31%,反基因锁核酸组肝组织切片中HBV HBsAg阳性细胞率明显小于拉米夫定组及反义锁核酸组(P<0.05).各组肝细胞切片中,肝组织结构和肝细胞形态正常,肾细胞切片中,各组肾小球结构完整,未见肾小球肥大,肾小球基膜和系膜基质未见明显病理改变和炎细胞浸润. 结论反基因锁核酸在转基因小鼠体
内能有效抑制HBV S基因表达,具有明显的抗病毒效果,为乙肝病毒的基因治疗提供理论依据和实验基础.%Objective There is still a lack of effective treatment for hepatitis B. The article aimed to investigate the inhibito-ry and antiviral effects of hepatitis B virus(HBV)S gene expression by anti-gene locked nucleic acid(LNA)in vivo in transgenic mice. Methods The HBV transgenic mice were divided into 5 groups by random number,6 in each group. They were blank group, irrelevant sequence group,lamivudine group,antisense locked nucleic acid group,and anti-gene locked nucleic acid group respective-ly. The lamivudine group was treated by oral gastric lavage,with 2mg/kg dose 2 times per day for continuous 7d,and the rest groups were injected with 500 mL by tail vein injection at 1,3,5 d after ad-ministration. HBV DNA was tested by real-time quantitative polymer-ase chain reaction(qPCR);HBsAg was tested by ELISA;mRNA of HBV S gene was detected by reverse transcription PCR(RT-PCR);the positive rate of HBsAg in liver cells was detected by immunohisto-chemistry. Results After the treatment of anti-gene locked nucleic acid on 3rd,5th,7thday,the inhibition rate of HBV DNA were 37.18%,50.27%,61.46%,and HBsAg were
30.17%,44%,57.76%. The inhibitory effect on 7thday was more obvious than those of the blank group,the unrelated sequence group,the lamivudine group and the antisense lock nucleic acid group,and the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of mRNA S gene HBV(0.33)and liver cells HBsAg positive rate(31%)was signif-icantly reduced compared with control group(P<0.05).No abnormal change was found in the function of liver and kidney tests and tis-sue HE staining.
Conclusion Anti-gene lock nucleic acid targeting to S gene has strong inhibitory effects on HBV replication and expression in transgenic mice,which provides theoretical and experimental knowledge for HBV gene therapy.
【期刊名称】《医学研究生学报》
【年(卷),期】2018(031)003
【总页数】6页(P267-272)
【关键词】乙型肝炎病毒;乙型肝炎;反基因治疗;锁核酸
【作者】肖树荣;许桂丹;韦武均;彭彬;邓益斌
【作者单位】533000百色,右江民族医学院附属医院医学检验中心;533000百色,右江民族医学院附属医院医学检验中心;533000百色,右江民族医学院附属医院医学检验中心;533000百色,右江民族医学院附属医院医学检验中心;533000百色,右江民族医学院附属医院医学检验中心
【正文语种】中文
【中图分类】R691.9
0 引言
全世界超过2.4亿人慢性感染HBV，其应用最多的药物是核苷酸类似物或干扰素等药物来抗病毒治疗[1]。

尽管抗病毒药物治疗作用不断改善，但每年死于乙型肝炎引起病发症的人数约有100万[2-3]。

这种抗病毒药物无法完全清除人体内的病毒载量[4-5]，因此需探索一种更有效的策略治疗HBV引起的乙型肝炎[6-7]。

锁
核酸是一种化学结构较特殊的双环状核苷酸衍生物，具有提高与杂交双链的亲和性、热稳定性、增强抗核酸酶降解能力、无毒等优点而被应用于基因治疗[8-13]。

本课题组利用反义锁核酸在抗HBV治疗中发现其能有效抑制HBV的复制和表达[14-18]。

本研究的反基因治疗，其机制是由外源特定寡聚脱氧核苷酸与病毒双链
DNA的特定区域专一性结合，形成三链DNA分子，从而阻断靶基因的转录与复制，实现“反基因”目的。

前期体外试验研究结果表明反基因治疗能有效抑制HBV的复制与表达[19-21]。

为了进一步探讨反基因锁核酸在体内的抗病毒效果，本文以HBV S编码链设计的反基因锁核酸，用脂质体转染，经小鼠尾静脉注射将
反基因锁核酸导入肝细胞核内，观察其在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果。

1 材料与方法
1.1 材料 HBV转基因小鼠30只，雌雄各半，体重19～23 g，购于广州解放军第四五八医院，实验动物许可证号：SCXK(军)2012-0018。

小鼠饲养环境：恒温
24 ℃左右，小鼠自由摄食、饮水，每日8：00-9：00喂食，更换垫料1次；反
义锁核酸、反基因锁核酸交给上海生工合成；脂质体转染试剂为Polyplus公司；贺普丁拉米夫定片购自葛兰素史克制药(苏州)有限公司；HBV表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司；HBV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光
探针法)购自中山大学达安基因股份有限公司；TRNzol Universal总RNA提取试剂、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、PCR MasterMix为TIANGEN产品；小鼠抗人HBsAg单克隆抗体、通用二步法检测试剂盒、DAB显色液购自北京中
杉金桥生物技术有限公司；正置荧光显微镜为OLYMPUS。

1.2 方法
1.2.1 反基因锁核酸的设计与合成根据基因测序的结果，HBV的病毒亚型为ayw。

针对HBV S编码链利用RNA structure软件设计反基因锁核酸片段，利用
Walk(步移)功能选择△G37 值较小的片段，经 Blast 分析序列特征及同源性，交给
上海工生公司合成并纯化。

1.2.2 脂质体包裹锁核酸的制备用10%GLU(glucose)分别稀释反基因锁核酸、反
义锁核酸、无关序列终浓度为5%GLU DNA混合液250 μL；用10%GLU稀释脂质体终浓度为5%GLU脂质体溶液250 μL；最后两者充分混匀并室温孵育15 min 待用。

1.2.3 HBV转基因小鼠的处理采用随机数字表分组法将30只HBV转基因小鼠平
均分为5组，每组6只，分别为空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组。

空白组、无关序列组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组于第1、3、5天经尾静脉分别注射5%GLU-脂质体、5%GLU-脂质体-无关序列、
5%GLU-脂质体-反义锁核酸、5%GLU -脂质体-反基因锁核酸各500 μL。

拉米夫
定组以2 mg/kg剂量每天灌胃2次，连续7 d。

于注射前和注射后第1、3、5、
7天经眶静脉采血，并2 h内用离心机(离心半径10 cm)5000 r/min离心5 min，分离血清到编好号的无菌EP管，贮存到-20 ℃冰箱备用。

注射后第7天取小鼠肝、肾于RNA保存液和4%多聚甲醛溶液保存。

1.2.4 血清HBV DNA的检测采用PCR-荧光探针法检测血清HBV DNA。

分别取30 μL待测样本、阳性定量参考品、质控品加入70 μL DNA提取液，剧烈振荡15 s，100 ℃处理10 min，以离心半径10 cm、12 000 r/min离心5min，备用。

在30 μL配好的PCR反应液中加入提取好的DNA样品20 μL，以离心半径10 cm、8000 r/min离心数秒后转移至扩增检测区，按以下条件扩增：①93 ℃预变
性2 min；②93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，共10个循环；③93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，共30个循环；④40 ℃ 20 s。

根据标准曲线计算出各样品HBV DNA的值。

1.2.5 血清HBsAg的检测利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HBsAg，具体
操作方法严格按照试剂盒说明书执行，实验完成后用酶标仪采用450 nm波长读
取各孔A值。

1.2.6 肝HBV S基因mRNA的检测取给药后第7天小鼠肝到RNA保存液保存。

无酶EP管中加入1 mL TRNzol和0.7 cm×0.4 cm肝迅速匀浆，室温静置5 min，以离心半径10 cm、12 000 r/min 离心10 min，取上清，加氯仿并剧烈振荡，
离心后取水相(约500 μL)转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇混匀。

再离心
去上清，加入75%乙醇洗涤沉淀，最后加入50 μLRNase-Free ddH2O，充分溶
解RNA。

去除RNA提取液中DNA，然后置于冰上进行反录转，得到的cDNA放置于冰上。

在PCR扩增体系中加入2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、cDNA 1
μL、针对HBV S区设计的上游引物为5′-CTGCCTCTCCCTTATCGTCA-3′，下游
引物为5′-TGGCAAGGACCCATAACTTC-3′各1 μL，加ddH2O 补至25 μL体系。

PCR扩增条件为：①94 ℃ 3 min；②94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s ，72 ℃ 1 min，共30循环；③72 ℃ 5 min，PCR产物长度为830 bp左右。

利用软件Image j计算扩增产物电泳条带与内参GAPDH条带相对强度的比值，以确定HBV S基因的mRNA在各治疗组中的抑制程度。

1.2.7 免疫组化技术检测小鼠肝组织中的HBsAg含量于给药后的第7天处死小鼠并取肝于4%多聚甲醛溶液固定24 h，再进一步脱水、石蜡包埋、切片，采用二
步免疫组织化学法操作，并进行DAB染色，苏木精复染，具体按试剂盒说明书操作。

正置荧光显微镜下观察肝组织中HBsAg的着色情况，以判断反基因锁核酸对肝细胞内HBsAg的抑制作用。

1.2.8 全自动生化分析仪检测小鼠血清肝、肾等器官功能全自动生化分析仪严格按照SOP文件进行操作，分析项目每日均做高、中、低值质量控制，确保在控后方
可检测小鼠血清中Alb、ALT、BUN、CR等肝肾功能指标，以判断脂质体混合物
对小鼠器官功能的损伤作用。

1.2.9 HE染色技术观察小鼠肝、肾等器官组织细胞结构变化小鼠肝、肾组织经石
蜡包埋、切片后，经HE染色，电子显微镜下观察小鼠各器官组织、细胞结构的改
变情况，以判断脂质体混合物对小鼠器官细胞的损伤作用。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析，定量资料以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 反基因锁核酸对HBV DNA的抑制效果给药后第3、5、7天，反基因锁核酸
组对HBV DNA复制的的平均抑制率分别为37.18%、50.27%和61.46%，第7
天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显增强
(P<0.05)。

空白组、无关序列组及拉米夫定组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 反基因锁核酸对HBV 合成HBsAg的影响给药后第3、5、7天，反基因锁核酸对HBsAg表达的平均抑制率分别为30.17%、44.00%和57.76%，第7天的抑制作用较空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

空白组、无关序列组及拉米夫定组差异无统计学意义(P>0.05)，见
表2。

表 1 反基因锁核酸对HBV DNA复制的影响
Table 1 Effects anti-gene LNA on HBV DNA replication (±s，×103 IU/mL)
组别nHBVDNA复制水平给药前给药后第1天给药后第3天给药后第5天给药后第7天空白组610.21±1.0510.00±0.9810.26±0.8510.16±0.8910.17±1.05*无
关序列组611.05±0.7910.85±0.9911.00±0.8011.02±0.7911.05±0.79*拉米夫定组610.80±1.4110.73±1.4210.42±1.5010.07±1.379.71±1.27*反义锁核酸组610.62±1.118.84±0.886.87±1.165.88±0.875.81±0.84*反基因锁核酸组
611.08±1.459.25±0.936.96±1.105.51±1.014.27±1.23
与反基因锁核酸组比较，*P<0.05
表 2 反基因锁核酸对HBV合成HBsAg的影响
Table 2 Effects of anti-gene LNA on HBsAg synthesis of HBV (±s)
组别nA值给药前给药后第1天给药后第3天给药后第5天给药后第7天空白组62.40±0.182.39±0.202.43±0.182.36±0.252.40±0.27*无关序列组
62.33±0.322.31±0.282.27±0.352.31±0.252.37±0.28*拉米夫定组
62.29±0.282.23±0.282.20±0.262.16±0.232.10±0.19*反义锁核酸组
62.26±0.272.01±0.281.66±0.191.46±0.161.30±0.16*反基因锁核酸组
62.32±0.351.95±0.411.62±0.321.31±0.290.98±0.12
与反基因锁核酸组比较，*P<0.05
2.3 反基因锁核酸对HBV S基因mRNA的影响HBV S基因mRNA反转录成cDNA扩增条带，在凝胶成像仪观察中，空白组和无关序列组亮度最强，拉米夫
定组和反义锁核酸组亮度较空白组降低，反基因锁核酸组亮度最暗，见图1。

与空白组、无关序列组、拉米夫定组和反义锁核酸组对比，反基因锁核酸能抑制HBV
S基因mRNA的表达(P<0.05)。

1：空白组；2：无关序列组；3：拉米夫定组；4：反义锁核酸组； 5:反基因锁核
酸组
与空白组、无关序列组、拉米夫定组比较，*P<0.01；与反义锁核酸组比较，
#P<0.05
图 1 各组对HBV-S基因mRNA表达影响
Figure 1 Results of HBV S-mRNA expression levels of each group
2.4 免疫组化学检测反基因锁核酸对肝组织HBsAg的影响显微镜下观察各组肝细胞中典型的棕黄色HBsAg阳性信号，分布于肝细胞细胞质内。

空白组、无关序列组、拉米夫定组、反义锁核酸组、反基因锁核酸组阳性细胞率分别为93%、92%、78%、47%和31%。

反基因锁核酸组肝组织切片中HBV HBsAg阳性细胞率明显
少于拉米夫定组及反义锁核酸组(P<0.05)，见图2。

a：空白组；b：无关序列组；c：拉米夫定组；d：反义锁核酸组； e:反基因锁核
酸组
与空白组、无关序列组、拉米夫定组比较，*P<0.01；与反义锁核酸组比较，
#P<0.05
图 2 各组肝组织HBV HBsAg分布情况(DAB染色×200)
Figure 2 Distribution of HBV HBsAg in liver tissues of each group (DAB
×200)
2.5 反基因锁核酸对肝、肾功能的影响 HE染色后，显微镜下观察各组肝肾组织结构。

各组肝细胞切片中，肝小叶结构和肝细胞形态正常，肝细胞条索排列规则，未见肝细胞变性、坏死等异常病理改变，见图3。

肾细胞切片中，各组肾小球结构完整，未见肾小球肥大，肾小球基膜和系膜基质未见明显病理改变、未见炎细胞浸润，见图4。

检测反基因锁核酸组血清Alb、ALT、BUN、CR等肝肾等指标，与空白
组相比，差异无统计学意义，说明反基因锁核酸对小鼠的肝肾功能及其组织结构均无明显影响。

a：空白组；b：无关序列组；c：拉米夫定组；d：反义锁核酸组； e:反基因锁核
酸组
图 3 各组肝切片细胞形态学检测结果(HE ×200)
Figure 3 Morphological changes in liver sections of each group (HE ×200)
a：空白组；b：无关序列组；c：拉米夫定组；d：反义锁核酸组； e:反基因锁核
酸组
图 4 各组肾切片细胞形态学检测结果(HE ×200)
Figure 4 Morphological changes in kidney sections of each group (HE
×200)
3 讨论
乙肝病毒属于双链DNA病毒，目前，HBV可被分为 A-J 共 10 种基因型，每种基因型又可进一步分为若干个基因亚型。

尽管 HBV 基因型不同，但基因组结构基本相似，都是一个由约 3.2 kb 碱基对组成的相对松驰不完全双链 DNA 环状分子，
有4个开放读码区，包括S区、C区、P区、X区。

本研究中选择S区S基因作为反基因治疗的靶点，一方面由于S基因编码的蛋白质分子是HBsAg的重要组成部分,不仅与病毒复制、转录、装配和分泌过程有密切关系，还与病毒感染引起的细胞及体液免疫应答反应有关。

另一方面，S区的序列在各型HBV间是十分保守的，S基因的保守性使与反基因锁核酸发生特异性结合，最终达到抑制病毒的效果。

本研究结果中，HBsAg含量与给药前、对照组相比有明显下降，与预期结果相符。

多年来，本课题组不断进行反义锁核酸基因治疗的研究工作，分别针对乙肝病毒S 保守区的前S1、前S2和S基因mRNA的翻译起始位点合成反义锁核酸片断。

结果发现，反义锁核酸对靶mRNA基因表达的抑制作用明显强于其他寡核苷酸，并且存在剂量和时间效应，当反义锁核酸片段长度在 20～25个核苷酸时，更容易
进入细胞内，与靶mRNA形成锁核酸-RNA杂交分子，封闭靶mRNA基团翻译
的同时，激活 Rnase H 酶活性，引起靶mRNA的降解，从翻译水平阻断病毒靶
基因表达，从而抑制 HBV 病毒的复制。

但值得注意的是，反义治疗的靶标是mRNA，而不是DNA，可能对DNA转录并未起到有效的抑制作用，因此容易产
生停药反弹。

本研究设计的反基因治疗，以复制、转录水平的DNA为靶标，用脂质体转染反基因锁核酸通过核孔与DNA发生特异性结合，使之形成锁核酸-DNA
杂交分子，达到从复制、转录水平上阻断HBV的合成与分泌可能会解决停药反弹的问题。

本研究结果显示，反基因锁核酸对HBV的 DNA和mRNA 、HBsAg、
肝组织中HBsAg阳性细胞各项招标均有明显的抑制作用，且与反义锁核酸相比有统计学意义。

但由于设计的原因，还没有直接的证据证明反基因锁核酸能效通过核孔与靶DNA发生特异结合，而可能与核外的mRNA结合产生的抑制作用，在进一步研究中可寻找有效方法如原位杂交法去验证。

总之，针对S基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸分子，在HBV转基因小鼠体内不仅能有效抑制乙肝病毒的复制和转录，而且在体内的安全无毒性，既为乙肝病毒的抗病毒治疗提供有效靶位，也为反基因治疗提供理论和实验依据。

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