生化实验六 酵母醇脱氢酶的提取与纯化

总活力＝活力单位数/ml 酶液X总体积（ml） 比活力＝活力单位数/mg蛋白＝总活力/总蛋白mg
每一步总活力 酶的回收率： 第一步总活力 ×100%
实验材料、试剂和器材
材料：酵母 试剂：3.0 mol/L 乙醇 、
0.06 mol/L焦磷酸钠（pH 8.5）、 0.0015 mol/L NAD+ 、 0.01 mol/L K2HPO4、 丙酮 （预冷）、 0.066 mol/L Na2HPO4 仪器：离心机、可见光分光光度计、紫外光分光光度计、水浴锅
（四） 有机溶剂沉淀酶蛋白
在上清中按100 ml加55 ml丙酮的比例，加入 预冷丙酮，混匀，静置5 min，4℃，5000 rpm离 心5 min。弃上清，沉淀溶于5.0 ml 0.01mol/L K2HPO4中，体积为V4，取2个1 ml分别于1.5 ml 离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶 活力） 。
（二） 热变性去除杂蛋白
剩余的上清在55℃保温15 min，间歇搅拌，冰 浴冷却，5000 rpm离心5 min，取上清，量体积V2 ，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中（一管用于测蛋 白浓度，一管用于测酶活力） ， 4℃保存备用， 剩余上清置冰浴中。
（三） 有机溶剂沉淀杂蛋白
将置于冰浴中上清，加上清体积一半的 预冷丙酮，混匀， 4℃静置5 min ，5000 rpm ，离心5 min，取上清，量体积V3，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中，4℃保存备用（一 管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力） ， 剩余上清倒入已置于冰浴中的50 ml离心管。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大 吸收波长在595nm，在0～100μg/ml，吸光度 与蛋白质含量成正比。
蛋白质与G-250反应在2 min内达到平 衡，且稳定，可检测微克级的蛋白质。
1、蛋白质标准曲线的制作
取6个PA瓶，配制0～100μg/ml 蛋白液各1.0 ml。加 5.0 ml G-250试剂，混匀，放置2 min，在595 nm比 色，绘管制号标准曲线。 1 2 3 4 5 6
蛋白质标准液（） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
蒸馏水（ml）
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100
A595
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
将样品提取液稀释50倍（参考值），吸取 1.0 mL放入PA瓶，加5 mL G-250试剂，混 匀，放置2 min，在595nm比色，记录吸光度 值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
1000mL。
F
回收率（%）
蛋白 质
G
酶总 活力
H
1.986
44.6
1450
32625 731.5 100 100
1.15
22.08
1300
24960 1130.4 49.51 76.5
0.468
10.764
800
18400 1709.4 24.1 56.3
0.259
1.295
850
4250 3281.8 2.9 13.0
每分钟A340增加0.001为1个活力单位。
酶活定义：每分钟A340增加0.001为1个活力 酶单液位加。入体积：0.2mL 酶液稀释倍数：10倍
1mL酶原液的酶活=A340*1000*10/0.2
样品编号 V1
A340/min
1mL酶原液的酶活 (U/mL)
V2
V3
V4
蛋白质含量测定（Bradford法）
酵母醇脱氢酶的提取和纯化
实验目的
掌握蛋白质提取、纯化、浓度测定和 酶活性测定的原理和方法。
实验原理
分离纯化
用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提 取一定纯度的醇脱氢酶。
醇脱氢酶催化的反应
醇脱氢酶可催化醇和醛之间的氧化还原 反应，辅酶是NAD+/NADH。
醇脱氢酶
CH3CH2OH + NAD+
CH3CHO + NADH + H+
乙醇过量时，NAD+被还原成NADH的速度与 酶活力成正比，NADH在340nm有较强吸收，可测 定单位时间内NADH的生成量，确定酶活力。
实验步骤
一、提取纯化酵母醇脱氢酶
（一） 粗提
称酵母粉2g，置研钵中，加半勺石英沙和Na2HPO4溶 液5mL，用力研磨10分钟，转入50 mL离心管，用20 mL Na2HPO4溶液洗研钵，转到离心管中，摇匀，静置5分钟 ，5000rpm离心5 min，取上清液，量取体积V1 ，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中，4℃保存（一管用于测蛋白浓 度，一管用于测酶活力），剩余的上清继续下一步纯化。
（四）计算 （按照测定的数据完成下表） C= A×B E=A×D F= D/B（或E/C）
提纯步骤
总体积 ml A
1.粗提
22.5
2.热变性除 杂
19.2
3.有机溶剂 除杂
23
4.有机溶剂 沉淀蛋白
5
蛋白浓度 (mg/ml)
B
蛋白总量 mg C
1mL酶活力 （U）
D
总活力 U E
比活力 (U/mg)
3.0mol/L 乙醇：174.6mL无水乙醇 0.06mol/L 焦磷酸钠（pH 8.5）：22.56g 焦磷
酸钠 0.0015mol/L NAD+：0.995g NAD + 0.01mol/L K2HPO4：1.74g K2HPO4 0.066mol/L Na2HPO4：9.37g Na2HPO4 上述试剂称量后，分别加蒸馏水定容到
仪器和试剂
仪器和用具 可见分光光度计，1.0 mL加液器，200μL加液 器；10 mL PA瓶。
试剂 （1）牛血清白蛋白100μg/mL（标准蛋白质） （2）考马斯亮蓝
100 mg G-250溶于50 mL 90%乙醇，加85% （W/V）磷酸100 mL，用水定容到1000 mL。
试剂配制
酶活力测定方法
1、将前面保存的上清用0.01mol/L K2HPO4稀释 第一步、第二、三、四步的酶液各稀释10倍备用
2、 准备5只试管，编号1-5，加入以下四种试剂
3.0M 乙醇 0.1ml 0.06M 焦磷酸钠 0.5ml 0.0015M NAD+ 0.3ml 蒸馏水 1.6ml
3.逐管加入0.2 mL已稀释的酶液，混匀后立即测定A340