钾离子浓度依赖的铅离子稳定G-四链体构型转化

钾离子浓度依赖的铅离子稳定G-四链体构型转化
于泽;李晓宏;李运超;叶明富
【摘要】已有研究普遍认为铅离子(Pb2+)诱导富G适体链形成的G-四链体(Pb2+-G4)比钾离子(K+)诱导富G适体链形成的G-四链体(K+-G4)更为稳定,因而Pb2+可以置换K+-G4中的K+,而且K+的存在不影响Pb2+-G4的稳定性.有趣的是本研究发现K+ (20 μmol·L-1-1 mmol·L-1)不仅可以诱导10 μmol·L-1Pb2+稳定的T2TT(Pb2+-T2TT,杂合G4结构)发生构型转换,甚至还可取代Pb2+-T2TT中的Pb2+,形成K+稳定的T2TT (K+-T2TT,平行G4结构),最终转化形成的K+-G4结构与单独K+诱导富G适体链形成K+-G4的构型基本一致.随后,进一步考察了另外7条富G适体链,发现这一转化过程具有一定的普适性.该研究结果为理解G4构型转化以及内嵌离子交换提供了新的视角,也为拓展G4在生化分析和生物领域的应用提供了新的理论基础.
【期刊名称】《物理化学学报》
【年(卷),期】2018(034)011
【总页数】6页(P1293-1298)
【关键词】铅离子;钾离子;G-四链体;核酸适体链;构型转化
【作者】于泽;李晓宏;李运超;叶明富
【作者单位】北京师范大学化学学院,北京100875;北京师范大学化学学院,北京100875;北京师范大学化学学院,北京100875;安徽工业大学化学与化工学院,安徽马鞍山243002
【正文语种】中文
【中图分类】O641.3
1 引言
G-四链体(G4)是由阳离子诱导富G核酸适体链形成的DNA二级结构1。

人体中
有大量的富G序列，主要分布于端粒和原癌基因启动子区域，这些序列与细胞调
控过程紧密相关2。

另外，目前已有许多人工合成的富G序列用于设计发展纳米
材料和分子器件 3–14。

G4的结构与性质直接影响到其在体内的生物功能和体外
的生化应用。

其中，金属离子诱导富G核酸适体链形成G4的结构稳定性，是决
定G4性质和功能的主要因素之一，因此，金属离子诱导富G适体链形成G4的构型研究广受关注15,16。

近年来，关于离子依赖的G4稳定性和拓扑结构的变化，一部分集中于单一离子的影响 17–24，一部分集中于共存离子的影响 25–28。

基于在生物体系以及大部分
的水相体系均含有不同浓度和不同种类的离子，研究共存离子对G4结构和性质的影响更具有普遍的科学意义。

据相关报道，相比于K+稳定的G4结构(K+-G4))，Pb2+稳定的G4结构(Pb2+-G4)具有良好的结构稳定性17–19,22,29–38。

因此，基于Pb2+不可逆地置换K+-G4中的K+，相继报道了一系列的离子检测传感器34,38–41以及逻辑器件 31,32,37。

然而，在这些研究工作中，均未考虑K+对
Pb2+-G4构型和稳定性的影响。

在本文中，通过系统地研究不同浓度钾离子对稳定Pb2+-G4构型的影响，发现
K+不仅会改变Pb2+-G4的构型，而且会置换其结构中的Pb2+进而形成K+-G4，这一影响表现出K+浓度依赖性。

进一步研究发现，对于不同的富G适体链，这一转化规律具有一定的普适性。

研究结果阐明了Pb2+-G4的结构稳定性对K+浓度
的依赖性。

2 实验部分
2.1 实验试剂
实验中使用的 DNA由上海生工生物有限公司合成，具体序列如下所示：
T2TT: 5’-GGGTTGGGTGGGTGGG-3’
PW17 (PW17212): 5’-GGGTAGGGCGGGTT GGG-3’
PW17111: 5’-GGGAGGGCGGGTGGG-3’
PW17211: 5’-GGGTAGGGCGGGTGGG-3’
PW17222: 5’-GGGTAGGGCTGGGTTGGG-3’
TBA: 5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’
Oxy28: 5’-GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTT TTGGGG-3’
PS2.M: 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’
三羟甲基氨基甲烷Tris，高氯酸钾，氯化钾，三水合高氯酸铅，均购于Sigma-Aldrich公司，并可直接使用。

冰醋酸购于北京化工厂，并可直接使用。

所有试剂均为分析纯，使用之前不再经过任何纯化。

实验过程中用水均为Millipore Milli-Q system (Thermo Scientific EASYpure)微孔过滤器过滤后的去离子水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

DNA母液的配制：用10 mmol·L-1 Tris-HAc缓冲溶液(pH = 8.0)配制 100
μmol·L-1 DNA，不同浓度的DNA溶液用10 mmol·L-1 Tris-HAc缓冲溶液(pH = 8.0)稀释可获得。

2.2 圆二色光谱法
室温 25 °C下，用 Chirascan型圆二色谱仪(Applied Photophysics Ltd)测量 4 μmol·L-1 DNA 与10 μmol·L-1铅离子(作用 1 h)的圆二色光谱；随后，再考察加入不同浓度钾离子(作用 1 h)的圆二色谱。

测试液定容1000 μL，4 μmol·L-1
DNA 用100 μmol·L-1 DNA 母液稀释获得，将 Pb(ClO4)2母液用缓冲溶液稀释
至100 μmol·L-1，后加100 μL 至DNA中，不同浓度的钾离子用浓度为50 mmol·L-1 KClO4溶液作为母液进行稀释获得，剩余体积的反应液为缓冲溶液，
反应液加至1000 μL后用混匀器使其充分混匀，静止使其充分反应后测圆二色谱。

比色皿光路长度为1 cm，体积为800 μL。

测试过程中通入高纯氮，扫描范围为220–340 nm，每个测试波长的停留时间为 0.5 s，每个样品重复测试两次，最终
谱图需扣除测试缓冲液的背景。

2.3 电喷雾离子化质谱法
质谱样品配制：如上述样品配制，先配置4 μmol·L-1的 DNA 样品，在进入质谱检测前加入TMAA (最终为100 mmol·L-1 和甲醇(最终为 20%)。

质谱条件：电
喷雾电压 2.5 kV，毛细管温度为150 °C。

HPLC 作为自动进样器，流速 2.50
μL·min-1。

所得结果使用ProMass软件解卷积处理。

3 结果与讨论
据报道，10 μmol·L-1 Pb2+可以诱导富 G 的核酸适体链形成G-四链体结构(G4)
6–9。

以T2TT适体链为例，以圆二色光谱表征其在Pb2+和K+存在条件下的构形转化。

如图1a所示，在10 μmol·L-1 Pb2+存在条件下，T2TT在310 nm处，
出现一个正峰；同时，在260 nm处出现一个正峰，在243 nm处出现一个负峰，表明T2TT适体链在Pb2+的诱导下形成了杂合结构的G4 29,30,32,34,39,41–43。

随后，在该体系中，逐渐加入0到1 mmol·L-1 K+，可以观察到：(1) 在310 nm 处的正峰逐渐减弱并向短波方向移动；(2) 在260 nm处的正峰逐渐增强并向长波方向移动至265 nm处；(3) 在243 nm处的负峰，逐渐增强。

结果表明，随着
K+浓度的逐渐增加，Pb2+稳定的T2TT所形成的G4结构，逐渐转化为平行的
G4结构。

当 K+的浓度达到 1 mm ol·L-1时，平行的 G4 特征峰与单独 1 mmol·L-1 K+存在条件下的G4特征峰相同，如图1b所示。

随后，采用电喷雾离
子化质谱(ESI-MS)进一步表征 T2TT 适体链分别在10 μmol·L-1 Pb2+，1 mmol·L-1 K+，以及10 μmol·L-1 Pb2+和1 mmol·L-1 K+条件下所形成G4结构中内嵌离子的种类，结果如图 1c所示。

在10 μmol·L-1 Pb2+存在条件下，T2TT适体链质核比为5312 (5105 + 207)，对应于Pb2+诱导T2TT形成的G4结构；随着K+浓度的增加，质核比为5312处的特征峰逐渐降低，并在质核比为5182 (5105 + 39 + 39)处出现了一个新峰且逐渐增加，对应于K+诱导T2TT形成的G4结构。

当 K+浓度达到1 mmol·L-1时，质核比为5312处的特征峰完全消失。

由此可以推测，K+取代了G4结构中的Pb2+。

据文献报道，Pb2+稳定的G4结构(Pb2+-G4)，其热力学稳定性要高于 K+稳定的 G4结构(K+-G4) 3–21，因此Pb2+可以置换K+-G4结构中的K+，但是K+的存在并不影响Pb2+-G4的稳定性。

这一研究结果进一步说明，K+的存在不仅影响了 Pb2+-G4结构的构型和稳定性，而且还可以置换出Pb2+-G4结构中的Pb2+。

图1 4 µmol·L-1 T2TT (a)在10 μmol·L-1 Pb2+以及不同浓度钾离子(0.02–1 mmol·L-1)加入到10 μmol·L-1 Pb2+体系中的圆二色谱图（由红到紫）；(b) 1 m mol·L-1 K+加入到10 μmol·L-1 Pb2+体系中(黑线)与单独1 mmol·L-1 K+存在条件下(红线)的圆二色谱图；(c) 10 μmol·L-1 Pb2+以及10 μmol·L-1 Pb2+稳定后加入不同浓度 K+以及单独1 mmol·L-1 K+存在条件下的质谱图Fig. 1 (a) CD spectra of 4 µmol·L-1 T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ and adding K+ (0.02 to 1 mmol·L-1) to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (from red to purple); (b) CD spectra of addi ng 1 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system(black) and that in the presence of only 1 mmol·L-1 K+(red); (c) ESI-MS of T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+with the subsequent addition of different concentrations of K+ (0.02 to 1 mmol·L-1), and in the pr esence of only 1 mmol·L-1 K+ (from top to bottom).
为了研究这一转化规律的普适性，将核酸适体链扩展到其他的适体链，如
PW17212，以及PW17212的衍生序列(通过变化富G单元之间的碱基个数)，如PW17111 (富G单元之间碱基个数为1)，PW17211 和 PW17222，分别研究在Pb2+，K+以及 Pb2+和 K+同时存在的情况下，G4结构的构型转化。

10 μmol·L-1的铅离子诱导4 μmol·L-1 PW17212(核酸适体链)发生构型转变，结果如图 2a所示。

在圆二色图谱中，在310 nm处出现一个正峰，在265 nm处出现一个负峰，对应于反平行G4结构的特征峰。

由此可以推断，10 μmol·L-1的铅离子诱导4 μmol·L-1 PW17212形成了反平行的 G4 结构(Pb2+-PW17212)。

随后，在该体系中，逐渐加入0–20 mmol·L-1 K+，反平行 Pb2+-PW17212 结构
在 310 nm处的正峰和在265 nm处的负峰逐渐减弱；相应地，在265 nm处的
正峰逐渐增强，呈现出了平行 G4结构的特征峰。

当 K+的浓度增加到 20 mmol·L-1时，Pb2+-PW17212的构型完全转化为平行的 G4，此时的 G4圆二
色特征峰与单独20 mmol·L-1 K+诱导4 μmol·L-1 PW17212 形成平行的G4
(K+-PW17212)特征峰基本吻合。

接着，将核酸适体链由 PW17212变化成
PW17111、PW17211、PW17222，在同样的条件下，研究K+对Pb2+-G4构
型的影响。

对于 PW17111 (图 2b)，Pb2+-PW17111是一个部分反平行的G4结构，随着K+的不断加入，反平行的特征逐渐减弱，平行的特征逐渐增加。

当K+
浓度达到0.5 mmol·L-1时，部分反平行的Pb2+-PW17111完全转化为平行的
G4结构。

对于PW17211 (图2c)，Pb2+-PW17211是一个反平行的G4结构，
随着K+的不断加入，反平行的特征逐渐减弱，平行的特征逐渐出现，并不断增强。

当K+浓度达到2 mmol·L-1时，反平行的Pb2+-PW17211完全转化为平行的
G4结构。

对于PW17222 (图2d)，Pb2+-PW17222是一个反平行的 G4结构，随着K+的不断加入，反平行的特征逐渐减弱，平行的特征逐渐出现，并不断增强。

当 K+浓度达到50 mmol·L-1时，反平行的 Pb2+-PW17222完全转化为平行的
G4结构。

由实验结果可以看出，对于一系列的PW17适体链，因富G单元之间
碱基数的不同，虽然K+均可以诱导Pb2+-G4发生构型转变，但是需要K+的浓度，则各不相同，随着富G单元间碱基个数的增加，发生构型转变需要K+浓度的阈值逐渐增加。

在保持富G重复单元保持不变的情况下，通过变化富G重复单元
之间的碱基个数，发现K+依然可以诱导Pb2+-G4发生构型转化。

图 2 PW17212 (a)以及 PW17111 (b)、PW17211 (c)和 PW17222 (d)在 10
μmol·L-1 铅离子和向10 μmol·L-1 铅离子稳定G4中加入不同浓度(mmol·L-1)钾离子的圆二色谱图Fig. 2 CD spectra of PW17212 (a), PW17111 (b), PW17211 (c) and PW17222 (d) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+and adding different concentration of K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system.
图3 4 µmol·L-1 TBA (a)、PS2.M (b)和 Oxy28 (c)在10 μmol·L-1 Pb2+ (蓝线)、10 mmol·L-1 K+ (红线)和向10 μmol·L-1铅离子稳定G4中加入10 mmol·L-1
K+ (紫线)的圆二色谱图Fig. 3 CD spectra of 4 µmol·L-1 TBA(a), PS2.M (b)
and Oxy28 (c) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ (blue), in the presence
of 10 mmol·L-1 K+ (red) and adding 10 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (purple).
最后，将适体链扩展到不同的富G重复单元，如含有两个G的重复单元TBA (图
3a)，含有三个G的重复单元PS2.M (图3b)，含有四个G的重复单元 Oxy28 (图
3c)。

对于TBA适体链，如图3a所示，在10 μmol·L-1铅离子存在条件下，TBA 形成反平行的G4结构，在10 mmol·L-1 K+存在条件下，形成平行的G4结构，在反平行的G4体系中，加入10 mmol·L-1 K+，反平行的G4构型转化为平行的
G4构型。

对于PS2.M适体链，如图3b所示，在10 μmol·L-1铅离子存在条件下，PS2.M形成反平行的G4结构，在反平行的G4体系中，加入10 mmol·L-1
K+，反平行的G4构型转化为平行的G4构型。

对于Oxy28，如图3c所示，在
10 μmol·L-1铅离子存在条件下，Oxy28形成反平行的G4结构，在10 mmol·L-1 K+存在条件下，形成平行的G4结构，在反平行的G4体系中，加入10 mmol·L-1 K+，反平行的G4构型转化为平行的G4构型。

由此可以看出，对于含有不同富G重复单元的适体链，依然可以观察到K+诱导Pb2+-G4的构型转化。

4 结论
综上所述，K+不仅可以诱导Pb2+稳定G-四链体(Pb2+-G4)发生构型转化，而且会进一步取代Pb2+-G4中的 Pb2+形成 K+-G4，构型转化后的 G4结构与单独K+诱导适体链形成K+-G4的构型基本一致。

这种构型转化以及离子取代过程具有钾离子浓度依赖性。

重要的是，这一转化趋势具有一定的普适性，与适体链中富G重复单元中G碱基的个数，以及与富G重复单元之间的碱基个数关系不大。

上述研究结果为研究G四链体构形转化和内嵌离子交换提供了新的视角，也为拓展G4在生物分析和生化应用提供了新的理论基础。

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