携绿色荧光蛋白和调控元件的人胰岛素原基因在HEPG2细胞的表达

【摘要】目的研究含绿色荧光蛋白(gfp)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体在hepg2细胞中的表达。

方法将ires egfp片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(plxsn gi ins)中,构建得到表达质粒plxsn gi ins egfp,经脂质体介导转染hepg2细胞后,各孔分别加入含有不同浓度葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察gfp基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值及考察细胞中胰岛素mrna的表达量。

结果成功构建逆转录病毒表达质粒plxsn gi ins egfp。

转染hepg2细胞后48 h,葡萄糖浓度为4.0,12.0,24.0 mmol/l,表达gfp基因的细胞数目占总细胞数目的比值分别为(4.00±0.15)%,(10.00±0.07)%, (25.00±0.10)%;胰岛素分泌量分别为(4.05±0.82),(8.67±0.62),(30.70±1.55)mu/l,不同葡萄糖浓度诱导的胰岛素mrna表达量明显不同。

结论含gfp和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体能够在hepg2细胞中成功表达,并且gfp基因的表达量反映了人胰岛素的分泌量。

【关键词】绿色荧光蛋白质类胰岛素逆转录病毒科转染基因细胞培养遗传载体
i型糖尿病(tidm)是一种t细胞介导的,以选择性易感人群胰岛β细胞损害、胰岛素分泌绝对减少为特征的自身免疫性疾病[1]。

近年来,i型糖尿病的基因治疗成为医学研究领域的热点问题之一,而基因治疗的关键是在体细胞中建立受葡萄糖浓度调控的胰岛素分泌功能,并且找到一种高效的基因转移载体和途径[2]。

研究表明可以通过报告基因的表达情况来间接反映目的基因的表达量[3 4]。

目前绿色荧光蛋白基因已被广泛用作原核细胞和真核细胞的报告基因,是活细胞的理想标记活物。

笔者利用亚克隆技术将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到重组载体中,建立通过报告基因检验目的基因表达的系统,检测该种细胞在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况,确定报告基因gfp的表达和人胰岛素分泌量之间的关系。

1材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒、菌株和细胞株质粒plxsn gi ins、pa317包装细胞、nih3t3由中国医科大学吴志香教授馈赠;质粒pires egfp(美国clontech公司);e.coli dh5α(日本takara 公司);hepg2细胞(第四军医大学实验动物中心);胰岛素检测采用双抗体酶联免疫试剂盒(瑞典mercodia公司)。

1.1.2主要药品和试剂限制性内切酶、t4连接酶、taq dna polymerase、dna marker dl2000、λ hi
ndⅲ(日本takara公司);g418(美国sigma公司);lipofectaminetm2000转染试剂(美国invitrogen生物制品有限公司);质粒提取试剂盒(美国qiagen生物有限公司);trizol reagent、逆转录聚合酶链反应(rt pcr)试剂盒(美国invitrogen公司);dmem(批号cat*no.sh30021.01,美国hyclone公司);小牛血清(批号atc:9934,美国hyclone pierce公司);其他试剂均为分析纯。

1.1.3pcr引物设计与合成根据胰岛素序列设计引物p1和p2,扩增长度为198 bp;根据人β actin设计引物p3和p4,扩增长度为206 bp,序列如下:
p1:5′ caacacctgtgcggctcag 3′
p2:5′ ttccacaatgccacgcttct 3′
p3:5′ attggcaatgagcggttccgc 3′
p4:5′ ctcctgcttgctgatgcacatc 3′
1.2方法
1.2.1重组质粒plxsn gi ins egfp的构建及筛选质粒pires egfp经ecorⅰ/xho ⅰ双酶切、末端平滑化后,克隆入t vector,得到pt ires egfp进行序列测定。

质粒pt ires egfp和plxsn gi ins分别经bamhⅰ/hindⅲ双酶切,回收目的片段,用t4连接酶在16 ℃连接过夜,连接产物转化e.coli dh5α,在含amp的lb平板上选择培养后,挑
取菌落,提取重组质粒。

将重组质粒分别转染于hepg2细胞中,用无血清的dmem 50 μl分别稀释质粒0.9 μg和脂质体 1.8 μg,将两者混合后,于37 ℃放置15 min使其形成lipofectamintm2000复合物,使其与原有培养液混匀。

将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的co2条件下培养6 h,分别加入4.00,12.00,24.00 mmol/l葡萄糖溶液,培养过夜,在倒置荧光显微镜下分别观察gfp基因的表达情况,并筛选阳性表达质粒。