离子交换层析法
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离子交换层析法
一、原理
离子交换层析法是从复杂的混合物中,分离性质相似大分子的方法之一,依据的原理是物质的酸碱性、极性,也就是所带阴阳离子的不同。
由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
二、方法与步骤:
1.实验试剂与仪器:可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水,层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂......
2.实验步骤
(1)装柱:
取出层析柱,用去离子水冲洗干净,连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次,每次10ml去离子水;取出填料,静止至室温后,根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱,用去离子水冲洗填料5个柱体积;
(2)柱的平衡与上样:
用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱,直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后,缓慢上样让蛋白充分结合;
(3)洗杂蛋白:
用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白,至流出液与缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
(4)解离目的蛋白(洗脱):
分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;
(5)柱的清洗与保存:
用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱,共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱,共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
三、适用范围与应用
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生
化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
离子交换层析在蛋白质分离纯化中有非常广泛的应用,在样品富集,中度纯化和精制阶段都可以采用.另外还可以利用离子交换层析去除DNA和内毒素.因此在生物制品工艺中应用非常广泛.关键是要选择合适的介质和分离条件.。