第5章同位素分析技术

抗体
免疫制备途径：
抗源或人工抗原 免疫 动物多抗 单克 隆化单抗
1）人工抗原的制备 具有重要生物意义的小分子半抗原 生物活性物质 药物(农药)
半抗原+蛋白质载体(HSA，BSA) 蛋白—
偶联剂
激活羧基(半抗原上)使之与氨基(蛋白上)缩合 生成—(CO—NH)—
抗原
选择性 培养
单抗纯化
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞
融合
抗体分泌 细胞筛选
克隆化
单抗制取
单抗鉴定
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞 50%PEG
1ml
培养液 10ml
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
2)平行稀释法 该法与上法类似，但当标记物的加入量不能
忽加量略入标时不记，同物分量，析的此时标时，准其可待量取测可两物忽份略w1等，和量因w样此2，品：然w后x，再分加别等
s1(wx w1) s2 (wx w2 )
若采用亚化学计量法分离，使 m1 m2 ， 有
s2 A2
B K[Q] K[q [PQ]) (3) F B [PQ] F p [PQ]
（ B ) p ( B )[PQ] [PQ] FF
p( B )
[
PQ]

1
F （ B
)
(4)
F
(4)代入（3）, 整理：
（ B )2 ( B )(1 Kp Kq) Kq 0 FF
非竞争 免疫放射分析 类型 结合蛋白--激素 竞争性结合蛋分析
受体-- 配体 竞争性受体-体配体分析
1.放射免疫分析(Radioimmunoassy,RIA)
建立在待测抗原物质对标记抗原与限量特异 性抗体的结合竞争抑制基础上的将免疫学反应高 度特异性与放射性测量高度灵敏性相结合的一种 超微量分析方法。 特点：灵敏度高(10-9 —10-12g)，特异性强， 重现性好，抗体可用免疫学方法根据需要制备。
重排上式，并假设
a127 u
100 %
，则尿样中未知
碘的摩尔数为
nu
ns

(
a129 s
R

a
127 s
)
考虑到质谱过程可能发生同位素质量歧视效应，
使得测定的R值带有系统偏差，应引入一系统校正 因子f,该因子可由对确切知道同位素构成的标样测 定而确定，即
f Rtrue / Rexp
式中，Rtrue是标准中确切已知的同位素比值，而 Rexp是质谱实际测定的同位素比值。
4.改进的亚化学剂量法(improved
substiochiometry istope dilution analysis)
1）定量示踪法 在分析样品时，同时取含待测物已知的标样，
分别加入等量的标记物，则：
w0 wx (w0 wx )
S0
Sm
w0 ws (w0 ws )
s1
A1
则
wx

A2w2 A1w1 A1 A2
5. 在现代仪器尤其是质谱分析中，同位素 稀释法常作为一种内标计量分析的手段。
举例
Max haldimann et al. Direct determination of yrinary iodine by inductively coupled plasma mass spectrometry using isotope dilution whih iodine-129.Clinical chemistry1998;44(4):817-824
Ag
*Ag.Ab B
Ag . Ab
Ag（应变量）与*Ag .Ab（自变量）间存在着逆 函数关系，可予以定量。
定量关系演释
假定 抗原( P )与抗 体(Q )反应 是均一 的单价结 合的 ， 则
P Q PQ
(1)
K k1 [PQ]
(2)
k2 [P][Q]
令 抗 源 与 抗 体 的 初 始 浓度 分 别 为p与q, 则
碘是单同位素元素，核素为127I，为此只能
以其长寿命的放射性同位素129I作为内标。样品
添加内标后，混合物中碘同位素核素的原子个
数比，相应于ICP-MS测定的129I与127I的强度比
值R，即
R

ns a1s 29 nsa1s27 nuau127
式中，n为碘的摩尔数，a为碘的同位素127或 129的丰度，下角标s和u分别代表内标和尿样。
a. 滴度——血清中抗体的浓度。定义为B/T%＝50%时抗血清的 稀释倍数。
K50

[Ag Ab] [Ag ][Ab ]

1 [Ab ]50
b. 特异性——抗原—抗体反应的专一程度。特异性高，则抗 干扰能力强。用抗原类似物交叉反应率描述。在[Ab]和 [Ag*]一定下，分别测定抗源及其类似物的反应剂量曲线 B/B0%-f(Ag),求出B50后按下式计算
最终，用ICP-MS测定尿碘的同位素稀释计量关系 式为
nu

ns
(
a129 s
R f

a127 s
)
§5.2 体外放射分析(in vitiro radioassay)
在体外条件下，以放射性标记的配体为示踪剂， 以竞争或非竞争性免疫结合为基础，以放射性检测 为定量手段的超微量物质分析技术。
竞争 放射免疫分析 抗体--抗源
3.亚化学计量稀释法(substiochiometry istope dilution analysis)
从稀释系统和示踪剂原液分离出等量的化合
物，同时测量，则因 m0 mm , S0 / Ss A0 / Am
有：
WX

W0
(
A0 Am
1)
等量分离可利用，难溶化合物的溶解度一定， 一定电量下电解质的析出量一定，吸附剂的饱和吸 附量一定，不足萃取剂的饱和萃取量一定等性质。
人工抗原(Artificial antigen) 把半抗原与 载体蛋白分子(人、牛血清蛋白)共键结合形成
标记抗原(Labelled antigen) 被放射性核素标
抗体(Antibody,Ab) 由抗原刺激动物机体产生 的免疫球蛋白，存在于血清中，所以常又称为
2)基本反原理
*Ag+Ab K1
F
+ K2
分离试剂
使游离抗原与抗原-抗体复合物相互分离的 试剂。
超微量的抗体-抗原复合一般不沉淀，需加入沉 淀剂使其与游离抗原分离，才能分别测定。
双抗法
一抗与抗原(标记+待测)温育，平衡后，加大量二抗使一抗-抗原复合物沉淀，离心分离进行测定。
吸附法
萄聚糖炭末法，炭粒外包以萄聚糖构成 沉淀剂，小分子可通过萄聚糖的筛孔被活性 碳吸附，而抗原一抗体被拒留在反应液中， 通过离心可使二者分离。
(
S0 Sm
1)
只需部分分离，测定 Sm。
例题
测定152.6mg蛋百质水解液中甘氨酸的含量。 为此，将比活度为96.2cpm/mg的5.07mg14C-甘氨 酸加到水解液，混均后分离出部分纯的甘氨酸， 测得其比活度51.3cpm/mg。
则
WX

W0
(
S0 Sm
1)

5.07(96.2 51.3

能在酪氨酰，组氨酰或赖氨酰残基间搭桥的双 功能重氮盐。
① 碳二亚胺法
② 混合酸酐法
③ 戊二醛法 ④ 琥珀酸酐法
⑤ 重氮化的对氨基苯甲酸法
2）抗血清的免疫制备
用抗原接种免疫动物，其成熟的B细胞克隆受到 抗原刺激后，产生分泌并分泌特异抗体到血清 和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆 抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。
1)

4.44(mg )
C 4.44 100% 2.91% 152.6
2.反向同位素稀释(inverse isotope dilution analysis)
又称逆稀释，用于测定射性物质，分析公式：
则，
W W0* (W W0 )
S0
Sm
W0

W
(
Sm S0 Sm
)
例题
常用，B / B0 %作为指示变量（B0为零管计数）， 并转换成Logit函数 令 y B / B0 则
logit ( y) ln( y ) 100 y
3）基本试剂
用于测定反应剂量曲线或制备标记抗原，纯 度应＞90%。
标记抗原
多肽类抗原常用碘标 原理 用氧化剂如氯胺T使 I*- 氧化成 I*，然后去取 代肽分子中酪氨酸残基苯环上的氢原子。
1)基本概念
抗原(Antigen,Ag) 能刺激动物的免疫系统产生 抗体(免疫原性) ，并与所产生的抗体能特异性 结合(反应原性) 抗原决定簇（Antigenic determinant) 在抗原 分子表面决定抗源与抗体特异性作用的特殊基 团，又称为表位(epitope) 半抗原 (hapten) 具有反应原性而不具有免疫
交叉反应(%)＝
B% 50%抗源 B% 50%抗原类似物
100
C. 亲合力—抗原—抗体结合强度。由平衡常数衡量决定，亲 和力强，检测灵敏度高。
3）单克隆抗体Monoclonal antibody,McAb: 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇
的同源抗体。
制备过程
1.致敏淋巴细胞的准备； 2.骨髓瘤细胞的准备； 3.细胞融合； 4.选择性培养； 5.抗体分泌细胞的筛选； 6.克隆化过程； 7.单克隆抗体的制备取
Ag *Ag Ab
Bound
Free
B
F B/F
0.67 0.33 2
0.50 0.50 1
0.33 0.67 0.5
0.17 0.83 0.2
竞争放射分析原理示意图
在A b

A
g

Ag ,且[Ab ]0 和[A*g ]一定的条件下，
B / F或B /(F B) f(Ag ) 反应剂量曲线。
核苷酸从头合成途径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成途径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
DNA
HAT选择培养原理
A
糖氨基酸
核苷酸
次黄嘌呤核 HGPRT 次黄嘌呤（H）
单磷酸
嘌呤类核苷酸
DAN 核苷酸
嘧啶类核苷酸
第5章 同位素分析技术
中国农业大学 齐孟文
第5章 同位素分析技术
§5.１同位素稀释分析方法(Isotope dilution analysis,ID)
1.直接稀释法
W0 Wx 稀释（W0 Wx )
S0
Sm
由稀释前后总活度不变,有:
S0W0

Sm (W0
Wx )或Wx

W0
碘是合成人体甲状腺激素所必需微量营养元素， 甲状腺激素在为维持机体能量代谢，促进人体骨骼 发育，脑发育和垂体的支持作用中具有重要的生理 作用，在碘缺乏地区，推行加碘盐是预防碘缺乏疾 病的国家行动，测定尿碘的浓度是指导补碘的基本 依据，而129I同位素稀释ICP—MS是一种最准确 的测定尿碘的方法。
理论：
S0
SS
sm(w0 wx ) ss (w0 ws ) s0w0 A
若 w0 wx, w0 ws
则
wx

ss sx
ws

As Ax
/ ms / mx
ws
若用亚化学剂量法分离出等量待测物，
则
wx

As Ax
ws
ms mx
避免该由法其不因必质知量道小所不加易入准标确记测物量的产量生w的0误，差从。而
测定小球藻14CO2光合作用生成的14C-蛋白质中 谷氨酸的含量。为此，取适量1测得其比活度为 254dpm/mg.在同样试样的水解液中，加入10.7mg非 标记谷氨酸，混合均匀后，分离出部分纯的谷氨酸， 测得其比活度为191dpm/mg。
则
191 Wx 10.7 254 191 32.44mg
胸腺嘧啶核苷 TK
单磷酸
胸腺嘧 啶核苷（T）
内源合成
外源合成
A：氨基碟呤，叶酸拮抗物；TK：胸腺嘧啶核苷激酶；
HGPRT次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转换酶
选择培养的细胞类型
骨髓瘤细胞（HGPRT-，或TK-),淋巴细胞 （ HGPRT+，或TK+）
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤
HGPRT
+ + — + —
生长状态
长期生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
HGPRT；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转换酶；TK:胸腺嘧啶核 苷激酶
有限稀释克隆法
计数
103/ml 102/ml 10/ml 0.5-2/孔
单克隆抗体的制取与鉴定
制取： 体外——培养罐法 体内——腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定——是否针对同一决定簇