小麦赤霉菌FGSG_04871基因敲除及功能研究

小麦赤霉菌FGSG_04871基因敲除及功能研究
彭海丽;侯占铭
【摘要】The Split-marker method was applied to construct the deletion cassette of the FGSG_04871 gene.The primers were designed according the sequence in the Fusarium Genome Database and the PCR products were transformed into the protoplast of wild type PH-1 by the PEG-mediated transformation method.Transformants were selected through medium containing hygromycin and then the knockout mutants were confirmed by PCR using positive and negative primers.Three deletion mutant of FG SG_04871 was obtained in this research,named △FGSG_04871 1-1、△FGSG_04871 1-3 and △FGSG_04871 2-1 pared with the wild type,the growth rate of FGSG_04871 deletion mutant was small slightly.There was no significant difference between mutant and wild type PH-1 in colony morphology and conidium morphology.The result of tomato infection experiment showed that deletion of FGSG_04871 gene did not reduce in virulence.However,the spore amount of deletion mutant was less than PH-1,therefore, FGSG_04871 gene may be related to conidia formation in Fusarium graminearum.%应用Split-Marker基因敲除技术,构建含有潮霉素抗性基因 hph 的基因敲除盒,由PEG介导,进行原生质体转化,在含有潮霉素的培养基上筛选转化子,应用PCR正负筛查确定缺失突变体.根据缺失突变体致病性的检测及表型变化对 FGSG_04871 基因的生物学功能进行分析.通过PCR正负筛选成功获得了3个敲除突变体,分别命名为△FGSG_04871 1-1、
△FGSG_04871 1-3、△FGSG_04871 2-1 .以野生型PH-1作为对照,敲除突变体的
菌落形态没有明显变化,菌落生长速度略微滞后,致病力没有减弱.但是,突变体的产孢量低于野生型PH-1,因此, FGSG_04871 基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关.
【期刊名称】《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》
【年(卷),期】2017(046)003
【总页数】7页(P394-400)
【关键词】小麦赤霉菌;FGSG_04871;Split-marker;基因敲除;致病力
【作者】彭海丽;侯占铭
【作者单位】内蒙古师范大学生命科学与技术学院,内蒙古呼和浩特 010022;内蒙古师范大学生命科学与技术学院,内蒙古呼和浩特 010022
【正文语种】中文
【中图分类】Q784
小麦赤霉病(Fusarium head blight)是由小麦赤霉菌引起的一种全球性病害[1],它与气候条件有关,小麦抽穗扬花期的降雨量、降雨日数和相对湿度是其病害的主要因素[2].小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)主要的真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)[3].小麦赤霉菌的无性世代产生分生孢子和有性世代产生子囊孢子[4].小麦赤霉菌基因组学的研究有助于确定小麦赤霉病的药物靶点,从而研制出抗菌疫苗和药物.目前,已有多个与小麦赤霉菌相关的致病基因被敲除、克隆和鉴定出来.Proctor等[5]敲除了与毒素合成有关的Tri5基因,Shim[6]研究了与真菌分泌毒素和雌性繁殖有关的FSR1基
因,Sonja等[7]发现了产玉米赤霉烯酮所必需的基因PKS4基因,樊飞宇等[8]敲除了
与子囊孢子生成有关的FgSWI6基因,Brunner K.等[9]鉴定了影响细胞壁完整性的基因XYR1,Lee S.H.等[10]克隆了影响小麦赤霉菌的有性和无性繁殖的SNF1基因,Hou等[3]探索了与雌性繁殖、异核体的形成以及侵染寄主等过程中有重要作用的基因MGV1.
在真菌中,cAMP信号通路对转录、形态及发育等生物过程都具有重要的调控作用.cAMP信号转导通路是通过胞外信号分子与相应受体的结合,引起胞内第二信使cAMP水平变化而导致细胞反应.在这个通路中主要的效应酶是cAMP磷酸二酯酶(cyclic AMP phosphodiesterase,PDE)和腺苷酸环化酶(adenylate
cyclase,AC),PDE是在降解水平上调节cAMP,而AC是在合成水平上调节cAMP,cAMP水平增高激活激酶A(PKA),PKA又通过使某些特异的转录因子进行磷酸化,介导cAMP引起的基因表达[11].本科研组敲除FgAC基因后,对其敲除突变体做了转录组测序分析,得出FGSG_04871基因是显著上调基因,并预测是转录调控RNA聚合酶Ⅱ的辅助因子,又由于FgAC基因依赖于cAMP的信号转导途径,因此,推测FGSG_04871基因对cAMP的信号转导途径有重要的作用.在小麦赤霉菌中,该基因并未被研究过,所以选择研究FGSG_04871基因.本实验通过基因敲除技术对FGSG_04871基因的功能进行了初步的研究.
1.1 材料
1.1.1 实验所用的质粒、菌株小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)野生型菌株PH-1和pCB1003质粒载体(含潮霉素磷酸转移酶基因),来源于美国普渡大学,由内蒙古师范大学生命科学与技术学院实验室保存.
1.1.2 引物设计在小麦赤霉菌基因数据库(Fusarium Comparative Database)中查询同源基因FGSG_04871基因序列(>F.graminearum PH-1(FG3) supercontig.3.3 of Gibberella zeae PH-1 [DNA] 509816-516930+),下载FGSG_04871基因及其上下游2 000 bp的碱基序列,根据下载的FGSG_04871基
因序列以及潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列设计PCR引物和检测引物,引物由上
海生工技术服务有限公司合成,引物见表1.
1.1.3 试剂、酶及培养基潮霉素(Hygromycin B)、Chitinase(几丁质酶)、Driselase(崩溃酶)、Lysing enzyme(溶菌酶)、LMT agar(低熔点琼脂)、2×Taq PCR Master Mix、PEG8000、真菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux)、普通质粒小提试剂盒(离心柱型,TIANGEN)、RNase、miracloth(Calbiochem)、0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)、10×TBE电泳缓冲液、0.5 mol/L Tris-Cl(pH=8.0)、STC buffer、PTC buffer、1.2 mol/L KCl溶液、原生质体Buffer.
TCC培养基、CMC培养基、TB3液体培养基、TB3固体培养基、YEPD液体培养基见文献[12].
1.2 研究方法
1.2.1 pCB1003质粒DNA的提取 pCB1003单菌落接种于3 mL LB液体培养基中,37 ℃、250 r/min震荡培养12～15 h.将培养后3 mL的菌液转移至1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心1 min,弃上清液,保留沉淀.后面操作按照普通质粒小提
试剂盒(离心柱型,TIANGEN)的步骤严格进行,得到pCB1003的质粒DNA进行琼
脂糖凝胶电泳检测.
1.2.2 小麦赤霉菌野生型菌株PH-1基因组DNA的提取把TCC固体培养基上的野生型PH-1菌丝接种于YEPD培养基中(含Amp),25 ℃、175 r/min震荡培养4 d.用双层无菌miracloth滤布过滤菌丝,尽量吸干水分,用锡纸包好,-80 ℃冰箱保存过夜,将冷冻的菌丝从冰箱中取出,在液氮中迅速研磨至粉末状.后面操作按照真菌基因组DNA提取试剂盒,BioFlux的步骤严格进行,得到PH-1基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.3 FGSG_04871基因敲除盒的构建以提取的PH-1 DNA作为模
板,FGSG_04871 1F/FGSG_04871 2R和FGSG_04871 3F/FGSG_04871 4R分别
作为引物进行PCR扩增.pCB1003质粒DNA作为模板,HYG/F-HY/R和YG/F-HYG/R作为引物对hph上下游序列进行PCR扩增.Split-marker重叠PCR扩增分别以FGSG_04871基因上游PCR扩增产物和hph基因上游PCR扩增产物作为模板,FGSG_04871 1F-HY/R作为引物; FGSG_04871基因下游PCR扩增产物和hph基因下游PCR扩增产物作为模板,YG/F-FGSG_04871 4R作为引物,在合适的退火温度下进行PCR扩增(图1),琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.4 FGSG_04871基因敲除与转化子的筛选鉴定 (1) 原生质体的制备与转化.将TCC培养基上活化3 d的野生型小麦赤霉菌PH-1的菌丝接种到CMC液体培养基中,25 ℃、175 r/min震荡培养4 d.双层无菌miracloth过滤孢子到50 mL离心管中,25 ℃、5 000 r/min,离心5 min.弃掉上清液,将沉淀用YEPD液体培养基重悬,25 ℃、175 r/min,震荡培养12 h,然后用无菌miracloth过滤收集菌丝,1.2 mol/L KCl冲洗2～3次,然后将适量菌丝刮到无菌的50 mL离心管中.过滤除菌现配制摇好的原生质体Buffer到装有菌丝的50 mL离心管中,30 ℃、80 r/min,摇床培养1.5～2 h.无菌miracloth过滤释放好的原生质体于三角瓶中,用1.2 mol/L KCl冲洗至100 mL,25 ℃、4 000 r/min,离心5 min.弃上清,加少量STC buffer 悬浮沉淀,STC buffer定容至50 mL,混合均匀,25 ℃、4 000 r/min,离心5 min.弃上清,加600 μL STC buffer轻轻悬浮,冰浴.将FGSG_04871基因重叠上下游各取10 μL和300 μL原生质体混合于15 mL无菌离心管中,轻轻混匀后室温静置20 min.取1.25 mL 40% PTC buffer加入离心管,混匀,室温静置20 min.加5 mL TB3液体培养基(含有50 μg/mL Ampicillin),25 ℃、80 r/min,震荡过夜培养.
(2) 转化子的筛选及鉴定.将过夜培养的原生质体25 ℃、4 000 r/min,离心5 min,弃上清液,加入10 mL LMT agar TB3固体培养基(含有终浓度250 μg/mL潮霉素和50 μg/mL Ampicillin),与原生质体混合均匀后倒入灭菌的90 mm培养皿内,25 ℃培养15 h.在25 ℃培养15 h的培养皿中再加入10 mL LMT agar TB3固
体培养基(含有终浓度250 μg/mL潮霉素和50 μg/mL Ampicillin)覆盖一层,25 ℃继续培养.3 d后长出单菌落转化子,挑取转化子到TCC固体培养基(含有150
μg/mL潮霉素和50 μg/mL Ampicillin)上继续筛选.选取与野生型PH-1单菌落直径有差异的转化子并提取DNA(参照1.2.2),野生型PH-1不能生长.以转化子DNA 作为模板,HYG/F-HYG/R与FGSG_04871 1F-HY/R作为引物进行正
筛,FGSG_04871 N1F/N2R作为引物进行负筛,琼脂糖凝胶电泳.
1.2.5 FGSG_04871敲除突变体表型观察和致病力检测将PH-1菌株、
FGSG_04871敲除突变体(△FGSG_04871)分别接种于CMC培养基中,25 ℃、175 r/min,震荡培养3 d,每种菌株做3个重复.双层无菌miracloth过滤孢子后使用血球计数板计数并观察分生孢子形态有无变化.接种菌株到60 mm和90 mm装有TCC培养基的培养皿上(含Amp),25 ℃静置培养,记录90 mm培养皿中菌落生长速度,观察60 mm培养皿中菌株形态区别,分别各做3个重复.将番茄用流动水洗净,再用70%的酒精消毒处理,然后用ddH2O冲洗干净,并用滤纸擦干后缓慢注入10 μL PH-1孢子和△FGSG_04871孢子,深度大约1.5 cm左右,标记.25 ℃静置培养,3 d后对比PH-1和△FGSG_04871对番茄的侵染情况,各做3个重复.
2.1 基因敲除盒构建结果及转化子的筛选鉴定
2.1.1 小麦赤霉菌PH-1基因组DNA和pCB1003质粒DNA的提取小麦赤霉菌PH-1基因组DNA和质粒pCB1003 DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,DNA片段大小分别为10 kb以上和4 000～5 000 bp之间,结果见图2.
2.1.2 FGSG_04871基因和hph基因上下游序列的PCR扩增分别对
FGSG_04871基因和hph基因上、下游序列的PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测,上游片段大小分别约为666 bp和764 bp,下游片段分别约为721 bp和931 bp,结果如图3所示.
2.1.3 Split-marker重叠PCR扩增重叠PCR扩增的上、下游序列经琼脂糖凝胶电
泳检测,片段大小分别为1 430 bp和1 652 bp,结果如图4所示.
2.1.4 转化子的PCR正负筛选结果见图5和图6.
引物FGSG_04871 1F和HY/R扩增产物长度为1 430 bp,引物HYG/F和HYG/R 扩增产物长度为1 380 bp,由于敲除突变体中FGSG_04871基因已被hph基因替代,因此只有敲除转化子才能扩增出预期条带.以敲除转化子DNA为模板进行PCR 扩增,电泳结果有预期条带.野生型菌株PH-1不能扩增出片段,电泳结果无条带.由于引物FGSG_04871 N1F和FGSG_04871 N2R设计于FGSG_04871基因内部,扩增产物长度为906 bp.因此敲除突变体的基因组不被扩增,而PH-1内含有此基因片段会被扩增出来.
2.2 FGSG_04871敲除突变体的表型观察及致病力检测
2.2.1 菌落形态通过3次重复实验对比TCC培养基上生长3 d的野生型PH-1和敲除突变体△FGSG_04871的菌落,发现△FGSG_04871敲除突变体菌落略小于野生型PH-1菌落,结果见图7.
2.2.2 菌落生长速度培养于TCC培养基上的菌株,经过3 d的连续测定与记录,绘制生长曲线见图8.从图8可以看出,敲除突变体△FGSG_04871的生长速度略慢于野生型菌株PH-1,通过统计分析,野生型PH-1与敲除突变体△FGSG_04871的菌落直径存在显著差异(P<0.05),见表2.
2.2.3 产孢子量变化分别吸取102 μL CMC培养基中的PH-1和△FGSG_04871分生孢子,用血球计数板进行计数,发现△FGSG_04871孢子的数量明显减少.野生型菌株PH-1的分生孢子量为8×105个/mL; 敲除突变体△FGSG_04871 1-1的分生孢子量是4×105个/mL; 敲除突变体△FGSG_04871 1-3的分生孢子量是5×105个/mL; 敲除突变体△FGSG_04871 2-1的分生孢子量是3×105个/mL.通过LSD分析,野生型PH-1与敲除突变体△FGSG_04871的分生孢子量有极显著的差异
(P<0.01,表2).
2.2.4 分生孢子形态观察在光学显微镜下观察25 ℃,175 r/min CMC培养基中生长的野生型菌株PH-1和敲除突变体△FGSG_04871的孢子形态,结果如图9所示.由图9可知，形状、横膈膜数量、大小等方面基本无差别，分生孢子的横膈膜数为3～7个,镰刀形.
2.2.5 番茄侵染实验将等量的分生孢子注入新鲜的番茄后,培养3 d观察到野生型菌株PH-1与△FGSG_04871孢子都可以侵染番茄,并且都出现腐烂区域,在注入部位都长出白色菌丝,侵染结果见图10.通过统计分析,敲除突变体△FGSG_04871与野生型PH-1的侵染直径差异不显著(P>0.05,表2).
通过用含潮霉素的培养基初步筛选转化子,再经过3组引物进行PCR筛选,确定敲除突变体.该实验最终得到3个FGSG_04871基因敲除突变体的菌株.对敲除突变体和PH-1在表型观察和致病力方面进行对比,发现FGSG_04871基因缺失菌株在生长过程中,菌丝生长速度略微滞后,分生孢子产量减少,对寄主的侵染能力没有下降,分生孢子形态没有变化.通过形态、生理、致病性及统计分析,得出FGSG_04871基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关,而FGSG_04871基因的功能尚未完全确定.
采用Split-Marker技术构建好基因敲除盒,并利用同源重组原理,预期获得hph基因取代FGSG_04871基因的敲除突变体.首先,通过抗药性的筛选,在含潮霉素培养基上可以存活并生长的均为转化子.然后单独对每个转化子进行培养,提取DNA进行PCR验证,该实验采用3组引物进行筛查.通过筛查符合预期的转化子被确认为敲除突变体△FGSG_04871.小麦赤霉菌营养体是单倍体,敲除突变体的表型不涉及显隐性关系而可以直接得到表现.以野生型PH-1作为对照,△FGSG_04871敲除突变体侵染番茄,通过统计分析没有显著差异,说明△FGSG_04871敲除突变体的致病力没有下降.对△FGSG_04871敲除突变体与PH-1菌落直径做显著性差异分析,其结果差异显著,菌落形态差异较小,说明FGSG_04871基因的缺失对菌落形态没有明
显的影响.分生孢子的形态没有变化,但产孢量减少,经统计分析△FGSG_04871敲除突变体与PH-1有极显著差异,推测FGSG_04871基因的缺失影响孢子的形成.因此推断FGSG_04871基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关.
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