新鲜血液白细胞计数参考方法的测量不确定度评定

新鲜血液白细胞计数参考方法的测量不确定度评定
郭晓俊;王青;宋颖;缪颖波;许蕾
【摘要】Objective To study the evaluation method and procedure on the uncertainty of leukocyte counts by reference method for fresh
blood.Methods The reference method recommended by the International Committee for Standardization in Hematology(ICSH) was used for leukocyte counts.The components of uncertainty were validated. The International Organization for Standardization(ISO) Guide to the Expression of Uncertainty of Measurement (GUM), type A and type B methods were used to evaluate each bined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated according to 95% confidence interval.Results The leukocyte counts from fresh blood had the average value of 6.71 ×109 /L.The combined standard uncert ainty was 0.097 ×109 /L(95% confidence interval, coverage factor k =2), and the expanded uncertainty was 0.19 ×109 /L.Conclusions The main sources of uncertainty are from the overlapped calculation correction and pipetting volume.Therefore, there should be strictly control on pipetting volume in order to make lower uncertainty.The evaluation model of uncertainty is established, which can be applied to the leukocyte counts and standardization, providing effective methods for traceability.%目的：探讨新鲜血液白细胞计数参考方法测量不确定度的评定方法和程序。

方法用国际临床血液学标准化委员会（ICSH）推荐的参考方法对新鲜血液样本进行白细胞计数；明确整个测定过程中测量不确定度分量来源，根据国标标准化组织（ISO）《测量不确
定度表述指南》（GUM）文件中有关测量不确定度的评估方法，按 A、B 两类不
确定度的计算方式对各分量分别进行评定，计算合成标准不确定度，最后取95％
可信区间，计算出扩展不确定度。

结果新鲜血液白细胞计数的均值为6．71×109
／L；合成标准不确定度为0．097×109／L，取95％可信区间、包含因子k ＝2，计算得扩展不确定度为0．19×109／L。

结论新鲜血液白细胞计数参考方法的测
量不确定度主要来源于重叠计数校正及加样体积。

因此，对血液样本的加样稀释和测定应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。

同时建立了白细胞计数测量结果不确定度评估模型，可应用于白细胞计数项目的量值溯源和标准化，为常规检测系统向参考方法溯源提供有效途径。

【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2015(000)005
【总页数】5页(P512-516)
【关键词】白细胞计数;新鲜血液;参考方法;测量不确定度
【作者】郭晓俊;王青;宋颖;缪颖波;许蕾
【作者单位】上海市临床检验中心，上海 200126;上海市临床检验中心，上海200126;上海市临床检验中心，上海 200126;上海市临床检验中心，上海 200126;上海市临床检验中心，上海 200126
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
自1993年国际标准化组织(International Standardization Organization，ISO)发布《测量不确定度表述指南》(Guide to the Expression of Uncertainty in
Measurement，GUM)以来，国际上表示测量结果及其不确定度在术语定义、概念、评定方法和报告的表达方式方面有了明确、统一的规定[1]。

2002年4月欧洲化学测量溯源性和质量改进网络组织(European Chemical Measurement Traceability and Quality Improvement of Network Organization，EURACHEM)和分析化学国际溯源性合作小组(Chemical Analysis of International Traceability Cooperation Group，CITAC)又共同发布了《分析测量中不确定度的量化》第2版[2]。

由于测量不确定度的概念在我国应用时间较短，中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)建议各实验室要逐步开展测量不确定的评定及
应用工作，特别是能提供校准服务的实验室必须进行不确定度的评定。

我们利用相关实验研究数据和文献资料，按GUM中测量不确定度评估方法和EURACHEM/CITAC指南中不确定度的评估方式，对白细胞计数参考方法进行了
测量不确定度的评定。

一、材料
1. 仪器Z2颗粒计数仪(美国Beckman-Coulter公司)。

100、500 μL移液器(美国Drummond公司和德国Brand公司)，20 mL A级容量瓶(德国Brand公司)，主要用于血液样本的稀释。

2. 试剂ISOTON II等渗电解质溶液和溶血素以及浓度质控物(批号7497030)、
乳胶标准颗粒CC Size Standard L10[批号9747287，直径9.805 μm，通过美国国家标准局(NIST)认证] 均由美国Beckman-Coulter公司提供。

3. 样本EDTA-K2抗凝新鲜健康人静脉血标本(4 h内)。

去除测定时不能有溶血
或有微小凝块标本。

二、被测量技术规定
1. 白细胞计数方法(1)原理：按国际血液学标准委员会(International Council
for Standardization in Haematology，ICSH)推荐白细胞计数参考方法[3]，采用半自动、单通道、电阻抗原理的颗粒计数仪；(2)测定条件：实验温度为
(20±2)℃；选择计数仪孔径大小为100 μm，用乳胶标准颗粒选择自动校准规程对100 μm孔进行细胞大小反应的校准；(3)测定流程：仪器校准、使用细胞质控品做室内质控、背景计数、新鲜血液样本0.08 mL加入20 mL容量瓶稀释一定倍数后再加入500μl溶血素溶解红细胞、样本测定、重叠计数校正、数值修约和结果报告；(4)具体计算公式，式中CWBC为血液样本中白细胞数量(个/L)、N0为计数仪显示的白细胞数量(个)、Nb为背景空白值(个)、Vreaction为计数仪计数体积(0.5 mL)、Vsample为样本体积(0.08 mL)、Vlytic为溶血素的体积(500 μL)；Vdilution为稀释液体积(20 mL)。

2. 重叠计数校正测定原理和条件不变。

测定流程：按ICSH推荐方法[3]，制备2套，每套制备4份原液白细胞稀释样本(0.02 mL+20 mL、0.04 mL+20 mL、0.06 mL+20 mL、0.08 mL+20 mL)，用溶血剂溶解红细胞，计数一定体积内的细胞数，重复检测次数分别为12、6、4、3。

重叠计数通过回归分析方法进行校正[3-5]，使用回归分析方法来检查回归的线性；如分析未显示非线性，那么回归直线的交点代表最大浓度原液稀释样本(0.08+20 mL)的重叠校准值。

用计数值乘以稀释倍数得出白细胞的计数值。

用最小二乘法估计得到一元线性回归方程为
y=bx+a。

式中y为细胞计数值、x为稀释浓度、b为斜率、a为截距。

三、识别不确定度的来源
测量不确定度来源包括溶液稀释配制过程、实验温度、仪器进样体积、背景空白计数以及重叠计数等。

按ICSH参考方法采用手工方式操作，因此还要考虑来源于不同人员测定时所加试剂、稀释液与样品体积重复性以及检测结果数值修约等方面的测量不确定度。

按CNAS GL06文件要求，对总体不确定度影响很小的分量，如比最大分量小1/3的分量可忽略不计[6]。

其中，实验温度为(20±2)℃，±2℃的温度
变化对体积影响所引入的不确定度很小，可忽略不计；背景空白计数按仪器说明书背景读数要求为每500 μL溶液中>20 fL颗粒应在25个以下，对总不确定度贡献很小，可忽略不计[7]；结果数值修约，每次计算过程对结果不修约，只对最后结
果进行修约，因此引入不确定度可忽略不计。

最终挑选出需要量化的不确定度分量包括移液器加样体积、稀释液容量瓶体积、仪器进样体积、重叠计数校正(线性回归)和测量时总重复性。

其中，重叠计数校正引入的不确定度分量考虑移液器加样
的体积和线性回归引入的不确定度，测量重复性、稀释液容量瓶的体积和仪器进样计数体积引入的不确定度与白细胞计数的相同，不需要重复考虑。

简化后不确定度计算数学模型为·fyep·fc(注：frep为测量时总的重复性；fc为重叠计数校正。

)
采用此测量数学模型绘制的修正因果关系图(鱼骨图)见图1。

四、量化不确定度
识别不确定度来源后，通过A类评定和B类评定方法量化这些不确定度来源所产
生的不确定度分量[6，8]。

1. 测量重复性(frep)引入不确定度当天抽取1例男性正常人新鲜血液样本，由2位工作人员每人稀释制备2份细胞悬液，在同一台Z2型颗粒计数仪上各重复测定5次，排除稀释液影响，弃去第1次测定结果，计算其余16次测定结果均值)为6.714×109/L，标准差(s)为0.073 9，重复性标准不确定度(urep)为=0.018
5×109/L，相对不确定度为=0.002 752。

2. 稀释过程引入的不确定度移液器加样的重复性不需要单独考虑，已计入总的
重复性测定的不确定度。

(1)移液器加样体积引入不确定度：用B类标准不确定度
评定。

根据上海市计量测试研究院出具的校准报告，80 μL移液器在20℃时的扩
展不确定度为u80=0.6 μL(k=2)，符合三角分布，所以移液器加样体积校准引入
的标准不确定度为=0.244 9 μL，相对不确定度=0.003 062；500 μL移液器在20℃时的扩展不确定度为U500=1.7 μL(k=2)，符合三角分布，校准引入标准不确定度
为=0.694 μL=0.000 694 mL；=0.008 189 mL，相对标准不确定度为=0.000 399 5。

(2)稀释液体积Vdilution+Vlytic：用B类标准不确定度评定，按上海市计量测试研究院20 mL单标线容量瓶校准报告，20℃时的扩展不确定度U=0.02
mL(k=2)，符合三角分布，校准引入的标准不确定度为=0.008 16 mL。

3. 计数仪计数体积引入的不确定度用B类标准不确定度评定。

颗粒计数仪的计
数体积是一个固定因素，无法直接测量，按厂商提供的数据，仪器计数体积为0.5 mL时其最大允许偏倚<1%[3,7]，符合三角分布，所以计数量的标准不确定度为
×0.5=0.002 04 mL；相对不确定度为=0.004 08。

4. 细胞重叠计数校正引入不确定度(1)移液器加样体积引入的不确定度：根据上
海市计量测试研究院出具的校准报告，20、40、60、80 μL移液器在20℃时的扩展不确定度分别为0.3、0.4、0.5和0.6 μL(k=2)，符合三角分布，校准引入标准
不确定度分别为=0.122 5 μL、=0.244 9 μL、，相对标准不确定度分别为=0.003 061。

(2)线性回归引入的不确定度：根据线性回归不确定度计算公式进行计算，
式中u(x0)为待测液稀释浓度xi的测量不确定度、p为被测溶液测量次数(平行样
本为2次)、n为重复测试的次数(拟合的总点数)、SR为残余偏差为第xi点带入曲线得到的理论值。

按ICSH推荐参考方法重叠计数校正进行测量，获得重叠计数原始数据见表1。

由表1可知参与标准曲线的点(n)=8；线性曲线方程Y=-
0.027X+6.74，相关系数(r)=0.964，斜率(b)=-0.027，截距(a)=6.74。

计数值与
理论值一一对应，见表2。

残余偏差(SR)=0.002 348；样品平行测定2次，重叠
计数校正值(y)分别为6.713 0和6.715 2，代入曲线方程得到的浓度xs分别为100%和91.85%，其标准不确定度为。

重叠计数校正值为6.713×109/L，所以相对不确定度=0.010 08。

(3)重叠计数校正合成相对不确定度：重叠计数校正测量
重复性、稀释液体积、溶血剂加样体积和计数体积引入不确定度与白细胞计数相同，无需重复考虑。

故重叠计数校正引入的相对不确定度为
urel,fc
=0.013 29
五、计算合成标准不确定度和扩展不确定度
在确定和量化了影响测量不确定度合成各分量后，计算合成标准不确定度(uc)和扩展不确定度(U)[6-7]。

计算公式为
式中urel,c为合成相对标准不确定度、urel,(xi)为各不确定度分量的相对标准不确定度；k为包含因子，k=2表示正态分布95%置信概率。

urel,c
=0.014 51；
uc=urel,c×C=0.014 51×6.714×109
=0.097 4×109/L
U=k×uc=2×0.097 4×109=0.19×109/L。

白细胞计数参考方法测量中各分量的相对贡献见图2。

新鲜血液白细胞计数参考方法测量数据及不确定度见表3。

本研究新鲜血液白细胞计数测定结果为
6.71×109/L，U=0.19×109/L(k=2)。

本研究根据GUM文件对白细胞计数参考方法进行不确定度评估，通过建立不确定度评估模型，探讨不确定度各分量对测量结果不确定度的相对贡献。

由表3和图2可知，重叠计数校正、计数体积和加样体积是影响测量不确定度的主要分量。

因此，对稀释液配制和测量应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。

其中，颗粒计数仪计数体积0.5 mL是一个固定因素，无法直接测量，只能由厂商提供数据计算。

稀释细胞因素主要受移液器校准影响，也是一个固有因素，理论上可将偏差减小为零，但在实际工作中操作比较困难，这些因素应在操作中予以重视。

对测量不确定度评估是一个很细致的过程，应注意质量保证，确保检测过程稳定并受控；有合格的操作人员，对仪器和试剂进行正确的维护和校准；使用经确认的分
析方法和文件化测量程序，使实验室检测结果具有溯源性。

在分析影响因素中，本研究考虑了计量器、测量条件、仪器性能、空白、重复等几个分量，但未涉及分析前因素和分析后因素，如采血抽样、基体效应、干扰、质量控制、参考区间等因素。

关于分析前因素和分析后因素对测量不确定度的影响尚需进一步研究探索。

随我国检验医学水平的不断提高和检验工作的日益规范以及近年来对检验标准化工作的逐渐重视，量值溯源、测量不确定度等概念受到越来越多的关注。

血细胞分析溯源存在困难，鉴于国际标准化机构目前还未建立血细胞分析参考实验室网络，并且建立血细胞分析参考方法的机构和参考实验室全国还不多，除建议常规检测实验室使用定值溯源至参考方法的校准物作为溯源标准外，还可以使用溯源至参考方法的定值新鲜血作为另一条可行的溯源途径，这样有助于解决当前血细胞分析溯源的实际问题。

以新鲜血作为校准物是有保存时间和条件限制的，需不同地区的比对实验室一起来承担建立溯源体系的工作。

如何发挥各地比对实验室的作用，如何开展比对实验室质量管理和监督工作还在探讨中[9]。

综上所述，参考方法测定新鲜血白细胞计数的测量不确定度主要来源于重叠计数校正和加样体积因素。

因此，对血样加样稀释和测定应严加控制，确保测量结果有较小的不确定度。

同时，本实验室依据ICSH推荐方法建立了白细胞计数参考方法，同时建立了白细胞计数测量结果不确定度评估模型，可用于白细胞计数项目量值溯源和标准化，为常规检测系统向参考方法溯源提供有效途径。

【相关文献】
[1] International Standardization Organization. Guide to the expression of uncertainty in measurement[R].Geneva：ISO，1995.
[2] European chemical measurement traceability and quality improvement of network
organization/chemical analysis of international traceability cooperation group. quantifying uncertainty in analytical measurement[S]. EURACHEM/CITAC，2000.
[3] International Council for Standardization in Haematology. Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes[J].Clin Lab Haematol，1994，16(2):131-138.
[4] LEWIS SM，ENGLAND JM，KUBOTA F. Coincidence correction in red blood cell counting[J].Phys Med Biol，1989，34(9):1239-1246.
[5] 彭黎明，蒋能刚. 血细胞参数检测的参考方法及其应用[J].临床检验杂志，2003，21(6):369-371.
[6] 中国实验室国家认可委员会. CNAS-GL06化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社，2006:6.
[7] 宋颖，胡晓波，居漪，等.红细胞计数参考方法的不确定度研究[J].检验医学，2005，20(3)：185-188.
[8] JJF1059-1999 测量不确定度评定与表示[S]．1999.
[9] 彭明婷，谷小林，陆红，等.我国血细胞分析参考系统的建立[J]．中华检验医学杂志，2006，29(3):196-198.。