幼兔颅盖骨成骨细胞的分离培养及鉴定

幼兔颅盖骨成骨细胞的分离培养及鉴定
艾力麦尔旦·艾尼瓦尔;李鹏;刁兆峰;木合塔尔·霍加
【摘要】背景:成骨细胞的提取分离尚无公认的高效简便的实验方法.目的:探讨用改良酶消化法体外分离、培养并鉴定新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞的实验方法.方法:实验利用成纤维细胞胰酶消化时脱壁早,终止消化后贴壁快的特点,采用改良酶消化法分离3 d龄新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞并用差速贴壁法纯化培养.倒置显微镜每日观察细胞形态及其生长状况,采用MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,测定碱性磷酸酶含量,免疫组织化学染色法检测Ι型胶原、骨钙素,Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,RUNX2)表达,茜素红染色矿化结节等对成骨细胞及其生物化学特性进行鉴定.结果与结论:①成功分离提取并差速贴壁法纯化培养成骨细胞;②分离培养的成骨细胞贴壁生长,显示正常的成骨细胞形态和生长特征;细胞增殖能力良好;③细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、RUNX2染色均阳性,常规培养21 d茜素红染色形成矿化结节;④结果证实,改良酶消化法培养出的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,成分单一,存活率高.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2019(023)007
【总页数】5页(P996-1000)
【关键词】成骨细胞;颅盖骨;改良酶消化法;差速贴壁法;分离培养;鉴定;兔;组织构建【作者】艾力麦尔旦·艾尼瓦尔;李鹏;刁兆峰;木合塔尔·霍加
【作者单位】新疆维吾尔自治区人民医院口腔科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830001;新疆维吾尔自治区人民医院口腔科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830001;
新疆维吾尔自治区人民医院口腔科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830001;深圳市
罗湖区人民医院,广东省深圳市 518001
【正文语种】中文
【中图分类】R446;R318
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文题释义：差速贴壁法：该方法主要是利用多聚赖氨酸，对成纤维细胞黏附力较强，对许旺细胞黏附力较弱原理，而将成纤维细胞黏附到玻片上，将含有非黏附许旺细胞的上清收集、离心、培养。

优点：速度快；许旺细胞产量高；不用抗有丝分裂药物抗血清和补体。

由于该方法是在分离获得细胞的同时，就去除了成纤维细胞，因此其速度明显快于其他方法，缺点是成纤维细胞含量较高于其他方法。

改良酶消化法：该实验对传统的成骨细胞培养法进行改良，首先分离骨组织时仔细分离表面纤维结缔及血管软组织，并将组织块儿剪成尽可能小的碎片，胰酶消化适当时间以清除对胰酶消化抵抗能力差的纤维结缔组织、松解成骨细胞，再用Ⅰ型胶原酶消化组织块，从而加快成骨细胞从骨碎片表面爬出的速度，提高得到的细胞数量，加上采用差速贴壁法纯化原代细胞从而消除成纤维细胞、破骨细胞、骨生成细胞等混杂细胞，可以有效提高成骨细胞的纯度。

0 引言 Introduction
随着骨组织工程技术的日益发展和深入研究，国内外学者的研究热点转移到如何更快速、更高效简便地获得高纯度、高活性的种子细胞并将其应用到研究中。

学者们已经从许多种动物的相关组织如颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功分离培养出了成骨细胞，新生动物或胚胎动物的颅骨为成骨细胞的常用来源。

自1979年
Mills等[1]首先报道体外成功分离培养人成骨细胞以来，对于成骨细胞的体外分离培养技术经历了很长的发展阶段，对其研究也日益深入，体外培养技术也日趋成熟。

传统成骨细胞的培养方法主要有酶消化法和组织块法，但这两种方法因为均存在一定局限性从而限制其应用。

该研究通过将前两者的精髓结合于身的改良酶消化法分离出兔颅盖骨来源的成骨细胞[2]，从形态、生长特征以及生物学特性等方面进行
鉴定，为成骨细胞相关组织工程研究提供效率高、耗时短、纯度高、操作简便的成骨细胞分离方法。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计细胞形态学与生物学特性鉴定实验。

1.2 时间及地点 2017年8月至2018年4月在新疆医科大学第一附属医院科技楼干细胞研究实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 实验用试剂与仪器胰蛋白酶、青链霉素溶液、碱性磷酸酶(ALP)染色液(北京索莱宝，中国)；碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成，中国)；Ⅰ型胶原酶(Worthington，美国)；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Amresco，美国)；骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)一抗(Abcam，美国)；Ⅰ型胶原(COL-I)一
抗(Novus Biologicals，美国)；Runt相关转录因子2(RUNX2)一抗(北京博奥森，中国)；碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)(北京索莱宝，中国)；山羊抗兔二步法检测试剂盒(北京中衫金桥，中国)；茜素红S(sigma，美国)；二氨基联苯胺染色试剂
盒(DAB)(北京中衫金桥，中国)；倒置显微镜(Leica，德国)；5%CO2恒温孵箱、
离心机、酶标仪(Thermo，美国)。

1.3.2 实验动物清洁级新西兰大白兔幼兔3只，3 d龄，体质量50-70 g，雌雄不限，由新疆医科大学实验动物中心提供。

实验动物生产许可证号：SCXK(新)2003-0002。

1.4 实验方法
1.4.1 成骨细胞分离培养并纯化将幼兔断颈处死，无菌条件下取出颅盖骨，剔除骨膜、血管和结缔组织等后放入预冷的高倍双抗液中浸泡10 min后移至培养皿加入PBS冲洗3次，然后将其切成大小约0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的碎块置入15 mL离心管中，加入3 mL
2.5 g/L胰蛋白酶(含有0.02%EDTA)，在37℃预消化20 min，加入3 mL完全培养液终止消化，弃上液，组织块PBS洗3次后加入质量浓度为1 g/L的Ⅰ型胶原酶5 mL，在37℃水浴箱中消化40 min，期间不停摇晃离心管让组织块充分与酶接触，加5 mL完全培养液终止消化，将混合悬液通过孔径为200目的细胞筛网，将未通过筛网的组织块拣出PBS冲洗3次，放入25 cm的培养皿中，加入10 mL完全培养液(含体积分数10%FBS、1%双抗的DMEM高糖培养液)，置入37℃、饱和湿度的体积分数5%CO2培养箱中培养，显微镜观察组织块游出细胞状况，每两三天换液1次，待细胞长满80%-90%首次传代。

1.4.2 差速贴壁法纯化成骨细胞[3-4] 实验对传统的成骨细胞培养法进行改良。

利用成纤维细胞胰酶消化时脱壁早，终止消化后贴壁快的特点对原代成骨细胞进行梯度纯化。

待原代细胞长满培养皿80%-90%后，用2.5 g/L胰酶消化接种至培养皿后37℃培养箱静置30 min，镜下观察大部分成纤维细胞已贴壁后轻轻转移上清液至另一培养皿置于培养箱再静置30 min，重复此过程两三次以得到高纯度成骨细胞，有效去除原代成骨细胞内混杂的成纤维细胞。

1.4.3 细胞形态观察原代培养后，倒置显微镜下每天观察细胞形态变化。

1.4.4 成骨细胞增殖活性的测定取第3代成骨细胞，计数后以2×106L-1细胞浓度接种于6块96孔板中，每组设5个复孔(其中一孔为空白对照)，细胞完全贴壁后开始实验，连续培养1，3，5，7，9，11 d后，分别取一块培养板用MTT法酶标仪测490 nm处各孔吸光度(A)值，取各组平均值，以细胞培养时间为横轴，A值为纵轴绘制生长曲线。

1.4.5 碱性磷酸酶染色取第3代成骨细胞，6×103L-1细胞浓度接种于24孔板中，细胞贴壁后开始实验，培养第7天弃培养液，按照碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶
联法)说明书进行操作，倒置显微镜下观察并拍照，碱性磷酸酶活性部位呈红色，
位于胞浆。

显微镜下每个孔选取中段图像，在100倍镜下，随机选取5个视野利
用cellSens Dimension图像分析软件分析每个视野中阳性面积所占比例，实验重复3次。

1.4.6 碱性磷酸酶活性测定取第3代成骨细胞，接种细胞浓度和方法同上，细胞贴壁后开始实验，常规培养1，3，5，7，9，11，13，15 d各取一块板按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，490 nm处酶标仪测A值并根据计算公式计算碱性
磷酸酶活性(金氏单位)，以培养时间为横坐标，A值为纵坐标绘制曲线。

1.4.7 免疫细胞化学染色取第3代成骨细胞，接种细胞浓度和方法同上，细胞贴壁后开始实验，常规培养第3，5，7天各取一块培养板，弃培养液PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定40 min，根据试剂盒说明书行免疫细胞化学染色(稀释比例分别为骨钙素1∶1 000、Ⅰ型胶原1∶300，RUNX2 1∶400)DAB显色，倒置显微镜
下观察并拍照，cellSens Dimension图像分析软件分析阳性率，方法同上。

1.4.8 茜素红染色取第3代成骨细胞，2×106/孔接种于六孔板中常规培养，两三
天换液1次，第21天弃培养液，PBS冲洗后用40 g/L多聚甲醛室温进行细胞固
定40 min，PBS冲洗，现配的1%茜素红染液(Alizerian Red S，ARS)1 mL室温孵育30 min后蒸馏水轻轻冲洗表面的染液，自然干燥，显微镜下观察矿化结节并拍照。

1.5 主要观察指标①成骨细胞形态观察；②细胞增殖活性；③成骨细胞碱性磷酸
酶表达；④碱性磷酸酶活性；⑤成骨相关蛋白表达；⑥成骨细胞茜素红染色结果。

2 结果 Results
2.1 细胞形态观察在倒置显微镜下观察，骨块植入培养皿48 h后可观察到有细胞
从组织块周围呈放射状爬出，见图1A，贴壁生长并包绕组织块聚集生长呈多个细胞团块，细胞形态多呈三角形，梭形，多角形等，细胞有长短不一的突起，细胞核一两个核仁，胞质丰富，7-10 d汇合达到80%-90%，进行首次传代，随培养时
间和代数增加细胞形态单一并可见复层生长情况，见图1B。

2.2 细胞增殖活性的测定结果细胞潜伏期约为3 d，随后进入对数增长期，约在第9天细胞达到平台期，见图2。

2.3 碱性磷酸酶染色结果偶氮偶联法进行染色，显微镜下见成骨细胞的胞质呈红颗粒状，即染色呈阳性，cellSens Dimension软件
分析结果显示碱性磷酸酶表达平均阳性率为96.41%，见图3。

2.4 碱性磷酸酶活性测定结果第3代成骨细胞碱性磷酸酶含量约培养第9天达到
高峰随后下降，见图4，表示成骨细胞分泌的碱性磷酸酶随着成骨细胞增殖分化而增加，随后细胞进入矿化成熟期，碱性磷酸酶分泌随之减少。

2.5 免疫细胞化学染色结果免疫细胞化学染色成骨相关蛋白表达结果显示，Ⅰ型
胶原3 d即出现强阳性表达，见图5A，cellSens Dimension软件分析结果显示
其阳性率97.83%，第5，7天逐渐减弱；骨钙素第5天出现弱阳性，第7天出现强阳性表达，阳性率91.39%，见图5B；RUNX2第5天出现强阳性表达，阳性率93.21%，见图5C。

2.6 成骨细胞茜素红染色结果成骨细胞常规培养第21天细胞汇合并且局部聚集成灶，细胞排列呈以矿化结节为中心的“火山口”样、旋涡状排列，大体观察可见白色结节，茜素红(ARS)染色即可见多个大小不等的矿化结节，见图6。

3 讨论 Discussion
成骨细胞的体外分离培养技术已经历了50余年的历史，细胞的常用来源主要有哺乳动物如大鼠、小鼠、犬和兔，亦有禽类如鸡和鱼类等[2，5]，其取材部位有颅骨、长骨、松质骨、下颌骨、股骨等[2，6-8]，其中颅骨因取材方便，极少混有混杂细胞，在成骨细胞研究中最常见。

新西兰兔作为中型动物，其具备和人类相似的生物
行为特征，其性情温顺，易饲养[9]，是研究成骨细胞以及用种子细胞移植于动物
体内治疗骨缺损及骨性疾病更为便捷的物种。

因此，实验选择新生新西兰大白兔颅盖骨为研究目标进行成骨细胞体外分离培养。

成骨细胞的传统体外培养方法有酶消化法和组织块法。

酶消化法虽然可以短时间内获得大量细胞，但本身存在缺点如酶消化时间难以控制，若消化时间过长则对细胞损伤大，细胞难以成活，反之，组织消化不彻底获取的细胞量少，细胞不易扩增从而影响细胞的贴壁和存活率，并且培养时尚需接种细胞必须达到一定密度才有利于细胞的自分泌和旁分泌作用充分发挥功效[10]。

组织块法操作简便、污染机会少，但其培养时间长、细胞产出率低并且细胞纯度不高，这使其在相关研究中的应用大打折扣。

该实验对传统的成骨细胞培养法进行改良，首先分离骨组织时仔细分离表面纤维结缔及血管软组织，并将组织块儿剪成尽可能小的碎片，胰酶消化适当时间以清除对胰酶消化抵抗能力差的纤维结缔组织、松解成骨细胞，再用Ⅰ型胶原酶消化组织块儿，从而加快成骨细胞从骨碎片表面爬出的速度，提高得到的细胞数量，加上采用差速贴壁法纯化原代细胞从而消除成纤维细胞、破骨细胞、骨生成细胞等混杂细胞，可以有效提高成骨细胞的纯度。

实验结果显示原代培养仅1周左右即长满培养皿
可传代，并且细胞很快进入对数生长期，此方法具有细胞游出时间短、缩短原代细胞培养时间、原代细胞培养数量扩增比率大的特点。

成骨细胞的分化过程包括细胞增殖阶段、细胞外基质形成及成熟阶段和骨基质矿化阶段，在不同分化时期伴随不同的生物学行为。

形态学观察、分泌的细胞外基质鉴定及矿化能力检测是目前被广泛采用的成骨细胞鉴定方法[11]。

特异性功能基因的序贯性表达伴随着成骨细胞的分化成熟过程，表达的这些基因成为鉴别成骨细胞的标志物，主要包括碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白、Osterix转录因子(Osterix，OSX)、RUNX2、骨涎蛋白等成骨细胞特异性表达基因[11-13]。

图1 兔成骨细胞形态观察(×50)Figure 1 Morphology of rabbit
osteoblasts(×50)图注：图A为幼兔颅盖骨原代成骨细胞第3天，细胞从组织块
儿周围爬出；B为第3代成骨细胞。

图2 第3代成骨细胞生长曲线Figure 2 Growth curve of passage 3 osteoblasts图注：细胞潜伏期约为3 d，随后进入对数增长期，约在第9天细胞达到平台期。

图3 第3代成骨细胞碱性磷酸酶染色(偶氮偶联法，×100)Figure 3 Alkaline phosphatase staining of passage 3 osteoblasts(Kaplow method，×100)
图4 第3代成骨细胞碱性磷酸酶活性Figure 4 Alkaline phosphatase activity of passage 3 osteoblasts图注：第3代成骨细胞碱性磷酸酶活性约培养第9天达到高峰随后下降。

图5 成骨细胞免疫细胞化学染色成骨相关蛋白表达(A，B：×100，C：
×200)Figure 5 Expression of osteogenesis-related proteins in osteoblasts detected by immunohistochemical staining(A，B，×100，C，×200)图注：
图 A为Ⅰ型胶原表达；B为骨钙素表达；C：RUNX2表达。

图6 成骨细胞茜素红染色结果(×200)Figure 6 Alizarin red staining of osteoblasts(×200)
实验采用倒置显微镜观察结果显示，原代成骨细胞形态多呈三角形、梭形或多角形，随着细胞成熟则形态趋向单一，以短梭形为主，随着培养时间增加，成熟的细胞可聚集呈放射状或栅栏状生长并且可相互重叠成多层，相邻细胞无接触抑制现象，也无细胞衰老现象，细胞附着的这种支架可能来源于成骨细胞分泌的Ι型胶原堆积而成的网状胶原纤维，胶原纤维组成的三维结构也是钙盐沉着，最后形成矿化结节的基础[14]。

成骨细胞膜表面表达高强度的碱性磷酸酶，是成骨细胞分化成熟的标记酶。

研究成
骨细胞常规培养第7天碱性磷酸酶染色阳性且阳性率96%以上，碱性磷酸酶活性
检测结果显示常规培养第10天碱性磷酸酶含量达到峰值，随后出现下降趋势，说明成骨细胞处于高度分化期，细胞外基质成熟并开始进入随后的矿化阶段，与国内外学者报道一致[15-17]。

矿化能力是成骨细胞的重要的生物学特性[18]，实验成
骨细胞常规培养21 d茜素红S染色可见大小不等的矿化结节，表明培养的成骨细胞具有良好的矿化功能。

Ⅰ型胶原是骨基质的重要组成部分也是成骨细胞重要的特异性基因，骨钙素为骨中特有的维生素k依赖钙结合小蛋白，在成骨细胞分化晚期开始活跃，其表达升高
说明成骨细胞开始进入矿化期[19]。

该实验成骨细胞常规培养第3天强阳性表达Ⅰ型胶原，第7天出现骨钙素阳性表达。

RUNX2又称核心结合因子Cbfα1，是成骨分化和骨形成过程中的重要调节因子，出现在成骨分化的早中期，可激活、启动下游包括碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原等基因的转录和表达，RUNX2的表达是成骨细胞开始分化的标志，有研究证实RUNX2在尚未成熟的成骨细胞中表达最高而随着成骨细胞的成熟其表达下降[20-21]。

此次研究第5天出现RUNX2阳性表达
表明成骨细胞开始出现分化，表明成骨细胞具有稳定的生物学特性。

实验通过改良酶消化法成功分离并培养新西兰大白兔幼兔颅盖骨成骨细胞并通过细胞形态观察，基质分泌物检测，免疫细胞化学染色和矿化结节染色等初步鉴定成骨细胞。

证实通过改良酶消化法能够短时间内分离高纯度、高活性、生物学性能稳定的成骨细胞，是进行成骨细胞体外培养甚为理想的方法，为后续骨组织工程及成骨细胞相关研究可以提供重要的实验依据。

作者贡献：艾力麦尔旦·艾尼瓦尔参与实验设计、实验实施、文章撰写及修改；李鹏，刁兆峰参与实验实施；木合塔尔·霍加参与实验设计、文章审校并对文章负责。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金资助项目(81560180)”的资助。

所
有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报
道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

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