基因工程专业大题

1.生物技术概念与特征
定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。

2.基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程
3.PCR反应体系基本原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
4.PCR反应参数：高温变性(94)，低温退火（60），适温延伸（72）
5.PCR反应体系：
（1）模板DNA（2）特异性引物dNTP
（3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）（4）缓冲溶液
6.PCR反应原则：
引物原则：（1）引物扩增跨度（2）引物解链温度
（3）避免引物内部或引物之间存在互补序列
（4）G+C含量：尽量控制在40%至60%之间
（5）引物的3‘末端特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对
（6）引物中有或能加上合适的酶切位点
7.分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

用途：（1）研究DNA之间的亲缘关系（2）发现基因的缺失或突变；
（3）测定某种遗传信息的量（4）鉴定某种基因（5）基因治疗
8.常用分子杂交类型：
（1）DNA印迹技术Southern blotting
（2）RNA印渍技术Northern blotting
（3）蛋白质印渍技术Western blotting
（4）斑点印迹Dot blotting
（5）原位杂交in situ hybridization
9.DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)
10.Sanger双脱氧链终止法原理：
（1）Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。

它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链
的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。

（2）如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的dNTP外，再加入一种少量的ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。

（3）在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。

对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以区分长度差一个核苷酸的单链DNA，就可读出序列。

11.限制性核酸内切酶的概念：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶
12.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity)：在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性
13.限制性核酸内切酶的命名原则：属名种名株名
Haemophilus influenzae d流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ
14.影响限制性核酸内切酶活性的因素：
①DNA样品的纯度，②DNA样品的甲基化程度，③酶切反应的温度，
④DNA分子结构，⑤核酸内切酶的缓冲液
15.同裂酶与同尾酶：
同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。

SmaIXmaI(CCCGGG)同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。

BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)
16.载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。

按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体17.克隆载体具备的条件：
（1）载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。

（2）载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。

（3）载体都具有合适的遗传标记基因。

（4）载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞
（5）载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。

（6）载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。

（7）载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。

（8）载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。

18.质粒(plasmid)的概念：独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子，天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型
19.标记基因：选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

20.筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来
21.融合基因(fusion gene):是指应用DNA体外重组技术,构建的一类含两个或两个以上的不同基因序列的杂合基因。

22.融合蛋白(fusion protein):是指通过将两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起并通过表达而形成的杂合蛋白
23.重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数
在常规实验条件下，重组率一般为25-75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA 重组的后续操作
24.受体细胞应具备的条件：
（1）限制性缺陷型，能使重组DNA稳定存在。

（2）重组整合缺陷型，重组DNA和宿主染色体间不发生同源重组。

（3）具有较高的转化效率。

（4）具有与载体选择标记互补的表型，便于重组体的筛选。

（5）感染寄生缺陷型,安全性高，无治病性。

（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。

25.大肠杆菌表达系统的优缺点
优点：（1）遗传背景清楚，便于基因操作。

（2）表达水平高，遗传较稳定。

（3）优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便。

被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统。

缺点：（1）缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等（2）细胞周质内含有种类繁多的内毒素.
26.大肠杆菌表达系统高效表达原理：
（1）表达载体的基本元件
（2）启动子与外源基因表达
（3）其它元件与外源基因表达
27.表达载体的基本元件：
A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因
B、转录元件：启动子、终止子
C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点
D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因
E、翻译后元件（非必须）：信号肽、融合肽
28.影响大肠杆菌的因素：
（1）启动子与外源基因表达.
（2）终止子
（3）核糖体结合位点
（4）质粒拷贝数（复制子）
（5）外源基因
29.以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点：
优点：（1）能简化外源基因表达产物的分离操作。

（2）能在一定程度上保持表达产物的结构稳定.
缺点：（1）包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活
性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至
关重要。

然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys
残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30% 30.包涵体的溶解与变性：
（1）表面活性剂（2）促溶剂（3）混合溶剂（4）极端pH
31.以分泌形式表达目的蛋白的优缺点：
优点：（1）目的蛋白稳定性高（2）目的蛋白易于分离（3）目的蛋白末端完整缺点：（1）相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。

（2）外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此
目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍32.以融合形式表达目的蛋白的优缺点：
优点：（1）目的蛋白稳定性高（2）目的蛋白易于分离
（3）目的蛋白表达率高.（4）目的蛋白溶解性好.
缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白
33.以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点：
优点：（1）目的蛋白高效表达.（2）稳定表达小分子短肽
缺点：（1）目的产物回收困难
34.以整合形式表达目的蛋白的优缺点：目的基因稳定表达.目的基因表达率低。