维生素E对顺铂所致的小鼠肾毒性的影响及其机制研究

●基础研究●
维生素E对顺铂所致的小鼠肾毒性的影响
及其机制研究
张　林1，刘伏友2，彭佑铭2，李大伟1，曾　妮1，武　蓉1，刘沧桑1
（1长沙市四医院肾内科，湖南　长沙，410006；2中南大学湘雅二医院肾脏病研究所，湖南　长沙，410008）
摘要：目的　观察维生素E对抗癌药物顺铂致小鼠肾毒性的影响及其可能机制。

方法　采用10 mg・kg-1顺铂腹腔注射诱导小鼠肾脏损伤，48小时后分别予维生素E 250 mg・kg-1和500 mg・kg-1口服灌胃，顺铂诱导72小时后通过检测小鼠血清尿素氮和肌酐水平评价肾功能的变化，检测肾组织中丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GPX）活性的变化，以评价小鼠肾组织氧化应激水平。

结果　与正常小鼠相比，10 mg・kg-1顺铂诱导的小鼠血清尿素氮、肌酐水平和肾组织MDA水平均显著升高（P<0.01），而肾组织SOD、CAT、GSH、GPX的活性均显著降低（P<0.01）；与10 mg・kg-1顺铂诱导的小鼠相比，250 mg・kg-1和500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠血清尿素氮、肌酐水平和肾组织MDA水平均显著降低（P<0.01），250 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织GPX的活性显著升高（P<0.01），500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织CAT和GPX的活性均显著升高（P<0.01），而三组之间肾组织SOD活性的差异无统计学意义（P>0.05）。

结论　高剂量的维生素E可以有效改善顺铂诱导的小鼠肾功能，可能与其降低肾组织的氧化应激有关。

关键词：维生素E；氧化应激；肾毒性；顺铂
中图分类号：R730.53　文献标识码：A　文章编号：2095-1264（2012）05-0343-05
d oi：10.3969/j.issn.2095-1264.2012.05.004
The Effect of Vitamin E on Cisplatin Induced Nephrotoxicity in Mice and its Mechanism Zhang Lin1, Liu Fuyou2, Peng Youming2, Li Dawei1, Zeng Ni1, Wu Rong1, Liu Cangsang1 (1The Forth Hospital of Changsha, Changsha, Hunan, 410006, China; 2The Second Xiangya Hospital of Central South
University, Changsha, Hunan, 410008, China)
Abstract:Objective To investigate the effects of vitamin E on cisplatin induced nephrotoxicity in mice and its mechanism. Methods 10 mg・kg-1 cisplatin was used to induce nephrotoxicity in mice by intraperitoneal injection, and 48 h later, 250 mg・kg-1 and 500 mg・kg-1 vitamin E were respectively used. Then at 72 h after cisplatin treatment, the serum level of urea nitrogen and creatinine were detected to evaluate the change of renal function, and the activities of malonaldehyde (MDA), superoxide dis-mutase (SOD), catalase (CAT), reduced glutathione (GSH) and glutathion peroxidase (GPX) in renal tissue were detected to evaluate the change of oxidative stress. Results Compared with normal mice, the serum level of urea nitrogen and creatinine as well as MDA in renal tissue significantly increased in 10 mg・kg-1 cisplatin-induced mice (P<0.01), while the activity of SOD, CAT, GSH and GPX in renal tissue were significantly reduced (P<0.01). Compared with 10 mg・kg-1 cisplatin-induced mice, serum level of urea nitrogen and creatinine as well as MDA in renal tissue of 250 mg・kg-1 and 500 mg・kg-1 vitamin E induced mice significantly reduced (P<0.01), and the activity of GPX in renal tissue of 250 mg・kg-1 vitamin E induced mice significantly increased (P<0.01), and so did the activity of GPX and CAT in renal tissue of 500 mg・kg-1 vitamin E induced mice (P<0.01), but no significant difference of the activity of SOD in renal tissue between the three groups was found (P>0.05). Conclusions High dose of vitamin E was effective to improve the renal function of cisplatin induced mice, and the decrease of oxidative stress may be involved.
Keywords: Vitamin E; Antioxidant; Nephrotoxicity
作者简介：张林，男，主治医生，研究方向：肾脏疾病和血液净化，E-mail: ssdlf@。

前言
顺铂是一种合成抗癌药物，被临床广泛用于治疗睾丸、卵巢、膀胱、头颈部癌症。

虽然高剂量顺铂可更有效地抑制癌细胞，但同时可导致不可逆转的肾功能不全、耳毒性及其他毒性［1］。

氧化应激在顺铂所致肾毒性中起着一定的作用［2］。

氧自由基（oxygen free radical, OFR）对维持机体的正常代谢起重要作用，主要表现在机体对危害物的防御作用中。

研究表明，在慢性肾脏疾病的早期阶段，一些氧化应激标志物的血浆浓度升高，且随着疾病的进展而逐渐升高［3-4］。

氧自由基有助于观察终末期肾脏疾病和血液透析治疗患者的并发症［3-4］。

抗氧化剂可以改善顺铂所致不同动物物种的肾毒性［7］。

维生素是细胞质和细胞膜中必不可少的非酶抗氧化剂，各种实验研究表明，维生素可有效防止肾氧化损伤［8-9］和应激所致的脑损伤。

维生素E是一种常用的具有抗氧化作用的维生素，本研究旨在探讨维生素E对顺铂致小鼠肾毒性的影响及其可能机制，以期为顺铂所致肾毒性的治疗提供更多的实验依据。

1　材料和方法
1.1　动物、试剂及药物　雄性昆明种小鼠，体重20～25 g（由中南大学湘雅二医院动物实验室提供），实验期间给予标准饲料，自由摄食饮水，室温控制在20～25℃。

维生素E胶丸（规格：0.1 g/粒）为浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产，顺铂由江苏豪森药业股份有限公司生产（商品名：诺欣，规格：2 mL∶10 mg）。

1.2　分组及给药　共分为四组，每组10只小鼠。

第一组为正常组，给予等体积饮用水灌胃；第二组为对照组，给予单纯顺铂腹腔注射（10 mg・kg-1）；第三、四组为维生素E治疗组，分别给予顺铂注射液（10 mg・kg-1）腹腔注射，48小时后再分别给予维生素E 250 mg・kg-1和500 mg・kg-1口服灌胃。

1.3　取材及样品制备方法　顺铂注射72小时后，乙醚麻醉处死动物，从小鼠的心脏采血，并分离肾脏，彻底清洗，冰浴条件下制成10％的组织匀浆离心（2000 rpm，10 min），取上清液于-20℃保存备测。

1.4　检测方法　谷胱甘肽（Glutathione, GSH）活性采用5，5'-二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）显色法检测。

丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量检测
可按公式：A532-A600=155000×C×L计算MDA
浓度C（μmol・L-1），进一步计算单位重量肾组织中
MDA 含量（μmol・g-1），式中A532和A600分别表示532 nm和600 nm处的吸光度值，L为比色杯厚度（cm）。

SOD的活性采用黄嘌呤氧化酶（XO）-细胞
色素C法测定，CAT的活性采用化学发光法测定，
GPX的活性采用DTNB法测定。

血清尿素氮和肌
酐水平采用全自动生化仪测定。

1.5　统计学处理　实验结果以x±s表示，采用
单因素方差分析组间差异，两组之间的比较采用
SNK-q检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
资料经正态齐性检验和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性，满足方差分析要求。

经方差分析，各组间差异显著（F=6.37，P<0.05），组间两两比较显示，与正常小鼠相比，10 mg・kg-1顺铂诱导的小鼠血清尿素氮、肌酐水平均显著升高（P<0.01）；与顺铂诱导的小鼠比较，维生素E（250 mg・kg-1）治疗组血清肌酐和尿素氮水平分别下降了44％和24％（P<0.01），维生素E（500 mg・kg-1）治疗组血清尿素氮和肌酐水平分别下降63％和43％（P<0.01）（表1）。

表1　各组血清尿素氮和肌酐水平的比较
Tab.1　Comparison of the serum urea nitrogen and creatinine
levels between different groups
Groups
Treatment
(mg・kg-1)
Urea
(mmol・L-1)
Creatinine
(μmol・L1) Normal
Cisplatin
Vit E+cisplatin
Vit E+cisplatin
Vehicle
10
250
500
6.1±1.5
22.0±1.5*
16.7±1.6**
12.5±1.0**
24.5±6.2
273.8±36.9*
153.2±16.4**
100.3±25.1** Values are mean±S.D. (n=10 animals). **P<0.01, compared with cisplatin group. *P<0.01, compared with normal group.
资料经正态齐性检验和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性，满足方差分析要求。

经方差分析，各组间差异显著（F=5.89，P<0.05），组间两两比较显示，与正常小鼠相比，10 mg・kg-1顺铂诱导的小鼠肾组织中SOD、CAT、GPX的活性均显著降低（P<0.01）；与顺铂诱导的小鼠比较，250 mg・kg-1和500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织中SOD 活性的差异均无统计学意义，而250 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织中GPX的活性均显著升高
（P<0.01），500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织中CAT、GPX的活性均显著升高（P<0.01）（表2）。

表2　各组小鼠肾组织中SOD、CAT、GPX活性的比较
Tab.2　Comparison of the activity of SOD, CAT and GPX in renal between different groups Groups Treatment (mg・kg-1)SOD (U/mg protein)CAT (U/mg protein)GPX(U/mg protein)
Normal
Cisplatin Vit E+cisplatin Vit E+cisplatin Vehicle
10
250
500
8.63±1.07
3.90±0.79a
4.26±0.50
5.34±2.59
37.72±4.67
22.12±2.74a
26.41±2.92
29.51±1.51**
25.55±1.86
14.26±0.76a
17.93±1.06**
19.49±0.52**
Values are mean±S.D. (n=10 animals). **P<0.01 compared with cisplatin group; a P<0.01 compared with normal group.
资料经正态齐性检验和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性，满足方差分析要求。

经方
差分析，各组间差异显著（F=8.74，P<0.05）,组间
两两比较显示，10 mg・kg-1顺铂诱导的小鼠肾组织
中GSH活性及MDA活性与正常小鼠相比，差异有
统计学意义，(P<0.01）；而与顺铂诱导的小鼠比较，250 mg・kg-1和500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠肾组织中GSH活性及MDA活性的差异均有统计学意
义（P<0.01）（见表3、图1、图2）。

图1　各组小鼠肾组织中GSH活性的比较
Fig. 1　The comparison of GSH activity in renal tissues of mice Values are mean±S.D. n=10. **P<0.01, compared with cis-platin group; *P<0.01, compared with normal group.
图2　各组小鼠肾组织中MDA活性的比较
Fig. 2　The comparison of MDA activity in renal tissues of mice Values are mean±S.D, n=10. **P<0.01, compared with cis-platin group; *P<0.01, compared with normal group.
表3　各组小鼠肾组织中GSH和MDA活性的比较Tab. 3　Comparison of the activity of GSH and MDA in renal
between different groups
Groups
Treatment
(mg・kg-1)
GSH
(nmol/mg protein)
MDA
(nmol/g wet tissue) Normal
Cisplatin
Vit E+cisplatin
Vit E+cisplatin
Vehicle
10
250
500
3.75±0.58
2.44±0.24a
3.37±0.69**
3.62±0.62**
117.81±5.91
134.66±3.93a
119.40±5.74**
115.82±6.10** Values are mean±S.D. (n=10 animals). **P<0.01, compared with cisplatin group; a P<0.01 compared with normal group.
3　讨论
既往的动物实验研究表明，对应临床上的顺铂治疗剂量，高剂量顺铂（10 mg・kg-1，腹腔注射）与低剂量顺铂（5 mg・kg-1，腹腔注射）均可导致动物的肾毒性［10-11］。

本研究结果也显示，10 mg・kg-1顺铂可显著升高小鼠血清尿素氮和肌酐水平，降低小鼠的肾功能。

铂在肾脏的聚集以及铂与肾脏蛋白的共价结合可能在顺铂致肾毒性中起了重要的作用，新近的研究表明，顺铂可抑制肾组织中抗氧化酶的活性［12］。

SOD、CAT和GPX活性可反映机体的抗氧化能力。

本研究结果显示，顺铂诱导的小鼠SOD、CAT和GPX活性均显著降低，表明顺铂可显著抑制小鼠肾脏抗氧化的能力。

SOD活性下降导致了脂质过氧化过程的启动和发展，可能归因于铜和锌的缺乏。

CAT 和 GPX的活性下降反过来又增加了过氧化氢浓度，增强脂质过氧化。

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合形成，半胱氨酸上的巯基为GSH的活性基团，易与某些药物、毒素等结合而具有整合解毒作用，可以对顺铂所致肾损伤起保护作用［13］。

作为GPX的作用底物，GSH可清除生物体内有害自由基（主要是氧自由基）或脂质过氧化
物，使其转换成脂肪酸和水。

众多的研究表明，肾
脏GSH的减少可大大增加顺铂的毒性和肾脏对化
学氧化损伤的敏感性。

MDA是氧自由基引起细胞
膜脂质过氧化反应的主要产物之一，对MDA的监
测可间接反映氧自由基的产生和过氧化反应的程
度。

本组研究结果亦显示，顺铂诱导的小鼠肾组织
中GSH活性显著降低，MDA活性显著升高，提示顺
铂可显著减弱小鼠肾脏抗氧化损伤的作用。

在动物实验中，单剂量维生素（1000 mg・kg-1，
腹腔注射）加硒能有效保护化学诱导的肾损伤［14，15］，
此剂量相当于人体最高剂量（500 mg・kg-1），高于美
国医学研究所食品和营养委员会推荐的可耐受最
高摄入浓度1 g /天。

然而，摄入高剂量维生素E，
只有很少的副作用，即使在剂量高达3200 mg /天
时，出现凝血缺陷也是由于维生素K缺乏或个人
接受抗凝血药物所致。

因此，本研究采用了250、500 mg・kg-1维生素E治疗顺铂诱导的小鼠肾功能不全，结果显示，经250、500 mg・kg-1维生素E治疗
的顺铂诱导的小鼠血清尿素氮和肌酐水平均显著
降低，提示其对顺铂诱导的小鼠肾功能损害具有保
护作用。

维生素E是所有定位于膜的脂溶性天然抗氧化剂中最具有代表性的， 维生素E可以直接清除氧自由基，与SOD、GPX一起构成体内抗氧化系统，使细胞膜及细胞内的核酸受到保护，免受自由基的攻击。

维生素E在体内和体外均具有强大的抗氧化作用，其抗氧化作用既与剂量有依存关系，也与不饱和脂肪酸的量和促化因子（如活性氧、铁）的量有关［16］。

近年来，维生素E被广泛用于多种疾病的防治。

有研究资料显示，人体维生素E摄入量与肿瘤呈负相关，但其抗癌机制尚不明确。

Ravo V等报道，维生素E在体内可作为第二道防御体系，其抗氧化功能对辐射损伤具有重要的防御作用［17］。

目前，随着更深入的研究，维生素E在临床上被发现有更多新的用途，如治疗消化性溃疡、防治新生儿溶血性贫血、增强肝细胞解毒功能等。

本组研究结果显示，250、500 mg・kg-1维生素E灌胃的小鼠，肾组织MDA水平均显著降低，GPX和GSH活性均显著升高， CAT活性仅在500 mg・kg-1维生素E处理的小鼠肾组织中显著升高，而250、500 mg・kg-1维生素E对顺铂诱导的小鼠肾组织中SOD的活性均无显著影响。

结合以上实验结果可以推测，维生素拮抗顺铂致肾损伤可能与以下机制有关：(1) 维生素E 的抗自由基作用：本实验各维生素E组肾组织的活性氧清除酶系（SOD、GPX、CAT）活性较顺铂组高，提示肾组织的活性氧清除酶系活性可以被维生素E 提高，并减少自由基在体内的过量蓄积。

(2) 维生素E的抗氧化作用：在本实验中，各维生素E组脂质过氧化产物MDA 的量明显减少， 提示维生素E可预防和阻止脂质过氧化损伤。

这一过程既可能与维生素E降低脂质过氧化酶的活性有关，也可能与维生素E作为供氢体，与不饱和脂肪酸竞争性结合自由基，以防止脂质的过氧化有关。

总之，本研究的结果显示，高剂量的维生素E 可有效改善顺铂诱导的小鼠肾功能，可能与其降低肾组织的氧化应激有关，但其具体机制仍有待于进一步的深入研究，以期为维生素E用于治疗顺铂化疗所致的肾毒性提供更多的实验依据。

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