一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.09.24
C N 104059117
A (21)申请号 201410298686.7
(22)申请日 2014.06.27
C07H 17/08(2006.01)
C07H 1/06(2006.01)
(71)申请人湖南海利化工股份有限公司
地址410007 湖南省长沙市芙蓉中路二段
251号
(72)发明人罗先福 曾雪云 王燕 刘世明
陈明 臧阳陵
(74)专利代理机构湖南兆弘专利事务所 43008
代理人杨慧
(54)发明名称
一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的
方法
(57)摘要
本发明涉及一种从刺糖多孢菌发酵液中提取
多杀菌素方法，包括以下步骤：①刺糖多孢菌发
酵液预处理，固液分离；②吸附剂吸附离心后水
相中的有机物；③合并一次和二次离心分离后的
固体，真空干燥；④固体中提取多杀菌素；⑤采用
溶剂重结晶得多杀菌素产品，减压脱溶。

本发明
预处理不需要加入极性溶剂浸取，从而大量减少
有机溶剂使用量，减少污染，降低成本，可采用离
心方法，操作安全，分离效果好，而且向水相中加
入吸附剂吸附水中有机物，
从而大幅降低废水中COD ，减小废水处理难度，所得产品多杀菌素收率
较高，总收率为70％～95％，产品纯化后多杀菌
素含量较高，质量含量为75％～93.2％。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页(10)申请公布号CN 104059117 A
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1.一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于包括以下步骤：
①刺糖多孢菌发酵液预处理，固液分离：预处理中所用碱液为质量百分含量20％～50％的NaOH 水溶液，调节发酵液pH 值＝8～10，室温搅拌15min ～30min 后离心固液分离；
②吸附剂吸附离心后水相中的有机物：吸附剂为膨润土、活性炭、大孔树脂、壳聚糖中的任一种。

吸附剂的加入量为一次离心后水相质量的0.5％～10％，温度在5℃～50℃，搅拌15～60min 后离心收集固体，二次离心后水相送废水处理；
③合并一次和二次离心分离后的固体，真空干燥：干燥温度30℃～80℃，干燥时间1h ～8h ；
④固体中提取多杀菌素：索氏提取法采用提取，所用提取剂为正戊烷、甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的任一种；溶剂加入量为固体质量的0.5倍～5倍，回流时间为1h ～8h ；
⑤采用溶剂重结晶得多杀菌素产品，再减压脱溶：所用溶剂为正戊烷、正己烷、环己烷、石油醚中的任一种。

权 利 要 求 书CN 104059117 A
一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从发酵液中提取抗生素的工艺，尤其是一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的新工艺。

背景技术
[0002] 多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的胞内次级代谢产物，它属于大环内酯类化合物。

到目前为止，从刺糖多孢菌发酵液中已经分离出了20多种多杀菌素组分，以及超过800种的多杀菌素合成和半合成类似物。

在天然多杀菌素分离提取的组分中，两个最高活性组分是Spinosyn A和D的混合物，被称为Spinosad，其化学结构式如下所示。

[0003]
[0004] 多杀菌素能有效控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫，同时对鞘翅目、直翅目、膜翅目、等翅目、蚤目、革翅目和啮虫目等某些特定种类的害虫也有一定的毒杀作用。

它具有杀虫谱广、高效、低毒、低残留和对非靶标动物无害等优点。

多杀菌素在国外已经投入使用多年，国内由美国陶氏益农公司(Dow A grosciences Company)生产的农药产品菜喜(2.5％多杀菌素悬浮剂)和催杀(48％多杀菌素悬浮剂)也已上市，并分别用于蔬菜和棉花的虫害防治。

[0005] 多杀菌素为带正电荷的弱碱性大环内酯类抗生素，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸丁酯、二甲基酰胺和乙腈等有机溶剂。

[0006] 目前有报道的多杀菌素提取分离的文献主要有吸附法和溶媒萃取法。

[0007] 吸附法是利用一种适当的吸附剂，把发酵滤液中的多杀菌素吸附，然后用有机溶剂把多杀菌素从吸附剂上洗脱出来，再经浓缩后即可得到多杀菌素的初制品。

吸附法的基本步骤是向发酵液中加入一定体积的丙酮等极性溶剂并充分浸取，过滤后，将滤液调至碱性，然后上吸附剂，再用有机溶剂洗脱多杀菌素A和D组分，其关键技术是吸附剂及吸附、解吸附条件的选择。

例如(1)陶氏益农的Baker P J等[US5227295，1993-07-13]以HP-20ss吸附树脂为吸附剂，以0％～95％甲醇：乙腈＝1：1(含0.1％乙酸钠)溶液梯度洗脱多杀菌素A和D组分，利用HPLC进行跟踪检测，并分段收集洗脱液，将多杀菌素洗脱液浓缩后将其用
石油醚稀释，稀释液上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和D的洗脱液；(2)王琨等[离子交换与吸附，2005，21(5)：444～451]用DM11树脂为吸附剂，最佳吸附pH9.5，上柱流速6BV/h，丙酮解吸流速1.5BV/ h，回收率较高，达到85.8％；(3)胡西洲等[华中农业大学学报，2006，25(4)：397～399]采用XAD-4大孔树脂为吸附材料，pH＝11，流速为1/6(L/min)，加入2％氯化钠条件下，采用丙酮梯度解吸，得出XAD-4大孔树脂吸附容量为1.09×104μg/mL(湿树脂)，吸附率为74.6％，解吸率为86.7％，收率达到64.7％；(4)李继安等[CN101560231B，2012-09-26]用大孔吸附树脂柱YPR-II为吸附剂，五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质，然后分别用20、10、1倍柱体积的浓度为40％、60％、80％，pH分别为7.0、9.0、7.0的丙酮水溶液洗脱吸附柱，最后用100％丙酮进行洗脱，合并洗脱效价较高的收集单元，进一步精制得到了多杀菌素粗制品，提取总收率达到70.1％，产品纯度为97％。

[0008] 溶媒萃取法的原理是利用多杀菌素与杂质在溶媒中的溶解度不同，将多杀菌素有选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂中，从而达到浓缩去杂的目的，例如夏立秋等[CN101906124B，2013-03-27]公开的溶媒法提取多杀菌素，具体工艺为：①发酵液预处理；
②加入高介电常数极性有机溶剂浸泡提取多杀菌素，进行固液分离，收集浸提清液；③通过真空浓缩，挥发除去高介电常数极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；④加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载有机相；⑤负载有机相中加入酸水进行反萃取，收集反萃取相；⑥挥发除去反萃取相中残留的萃取溶媒，用NaOH溶液调节pH＝8.5～11.5，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1～3次，真空干燥，即得到多杀菌素粉剂。

该发明总收率可达80％以上，但该专利未给出产品纯度的数据。

[0009] 树脂吸附提取法有产品纯度较高等优点，但该工艺目前存在吸附量小、解吸附困难、处理量小、对设备要求高、工序多、成本较高等缺陷，难以适应大规模工业化生产的要求；溶媒法提取多杀菌素具有成本低、易于工业化等优点，但所需溶媒量大，增加了废水处理难度。

此外，树脂吸附提取法和溶媒法都需要将大量甲醇或丙酮等极性有机溶剂加入到发酵液中浸提，会有大量溶剂损失，不仅提高生产成本，而且污染环境。

随着环保要求越来越高，树脂吸附提取法和溶媒法都难以适应工业化生产的发展。

发明内容
[0010] 本发明的目的是克服现有工艺上有机溶剂使用量大、废水处理难度高、环境污染严重等缺点，提供一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，技术方案如下：[0011] ①刺糖多孢菌发酵液预处理，固液分离；预处理中所用碱液为质量百分含量20％～50％的NaOH水溶液，调节发酵液pH值＝8～10，室温搅拌15min～30min后离心。

[0012] ②吸附剂吸附离心后水相中的有机物；吸附剂为膨润土、活性炭、大孔树脂、壳聚糖中的任一种。

吸附剂的加入量为一次离心后水相质量的0.5％～10％，温度在5℃～50℃，搅拌15～60min后离心收集固体，二次离心后水相送废水处理。

[0013] ③合并一次和二次离心分离后的固体，真空干燥；干燥温度30℃～80℃，干燥时间1h～8h。

[0014] ④固体中提取多杀菌素；采用索氏提取法提取，所用提取剂为正戊烷、甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷中的任一种。

溶剂加入量为固体质
量的0.5倍～5倍，回流时间为1h～8h。

[0015] ⑤采用溶剂重结晶得多杀菌素产品，减压脱溶；所用溶剂为正戊烷、正己烷、环己烷、石油醚中的任一种。

[0016] 本发明与提取多杀菌素现有技术相比，具有以下优点：
[0017] 1)在预处理阶段，本发明不需要加入与发酵液等体积的极性溶剂(如甲醇、丙酮)浸取，从而大量减少有机溶剂使用量，减少污染，降低成本；
[0018] 2)发酵液中含细小颗粒和胶质等复杂成分，预处理后固液分离方式选择压滤和抽滤的效果不好，而本发明在发酵液中未加入低沸点的极性溶剂，可采用离心方法，操作安全，分离效果好；
[0019] 3)现有技术都是向水相中加入大量有机溶剂，而本发明不仅不向水相中加入有机溶剂，而且向水相中加入吸附剂吸附水中有机物，从而大幅降低废水中COD，减小废水处理难度；
[0020] 4)产品多杀菌素收率较高，总收率为70％～95％；
[0021] 5)产品纯化后多杀菌素含量较高，质量含量为75％～93.2％(液相色谱，外标)。

具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施方式。

在不脱离本发明具体构思的前提下，所属领域的技术人员据此做简单的推演或同等替换方案，均属于本发明的保护范围。

[0023] 实施例1
[0024] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用30％NaOH溶液调节发酵液pH＝9，室温搅拌30min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入50g膨润土，室温搅拌30min后离心得固体56g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥5h得93g干燥固体；④采用索氏提取法，加入186g正戊烷，回流3h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正戊烷重结晶，得0.47g多杀菌素产品，含量90.0％(液相色谱，外标；组分A84.7％，组分D5.3％)，收率76.2％。

[0025] 实施例2
[0026] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用20％NaOH溶液调节发酵液pH＝8，室温搅拌15min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入50g活性炭，5℃搅拌60min后离心得固体58g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，30℃下真空(1.33kPa)干燥8h得92g干燥固体；④采用索氏提取法，加入92g甲醇，回流8h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g环己烷重结晶，得0.71g多杀菌素产品，含量75.0％(液相色谱，外标；组分A70.7％，组分D4.3％)，收率95.0％。

[0027] 实施例3
[0028] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用50％NaOH溶液调节发酵液pH＝10，室温搅拌15min后离心得固体53g；②在一次离心后的水相中加入50g大孔树脂，50℃搅拌15min后离心得固体57g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，80℃下真空(1.33kPa)干燥1h得91g干燥固体；④采用索氏提取法，加入455g乙醇，回流1h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.47g多杀菌素产
品，含量84.0％(液相色谱，外标；组分A79.1％，组分D4.9％)，收率70.0％。

[0029] 实施例4
[0030] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用40％NaOH溶液调节发酵液pH＝9，室温搅拌25min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入50g壳聚糖，30℃搅拌45min后离心得固体57g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥5h得92g干燥固体；④采用索氏提取法，加入368g正己烷，回流2h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.50g多杀菌素产品，含量93.2％(液相色谱，外标；组分A87.3％，组分D5.9％)，收率83.0％。

[0031] 实施例5
[0032] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用20％NaOH溶液调节发酵液pH＝8，室温搅拌30min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入20g活性炭，40℃搅拌50min后离心得固体23g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥4h得44g干燥固体；④采用索氏提取法，加入220g环己烷，回流3h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.55g多杀菌素产品，含量89.0％(液相色谱，外标；组分A83.5％，组分D5.5％)，收率87.3％。

[0033] 实施例6
[0034] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用40％NaOH溶液调节发酵液pH＝10，室温搅拌25min后离心得固体50g；②在一次离心后的水相中加入5g活性炭，50℃搅拌15min后离心得固体6g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，60℃下真空(1.33kPa)干燥2h得48g干燥固体；④采用索氏提取法，加入144g 石油醚，回流3h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.53g多杀菌素产品，含量88.4％(液相色谱，外标；组分A83.3％，组分D5.1％)，收率83.8％。

[0035] 实施例7
[0036] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用50％NaOH溶液调节发酵液pH＝8，室温搅拌30min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入94.8g活性炭，30℃搅拌30min后离心得固体106g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥5h得138g干燥固体；④采用索氏提取法，加入276g乙酸乙酯，回流1h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.59g多杀菌素产品，含量82.7％(液相色谱，外标；组分A77.3％，组分D4.6％)，收率87.0％。

[0037] 实施例8
[0038] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用50％NaOH溶液调节发酵液pH＝8，室温搅拌30min后离心得固体50g；②在一次离心后的水相中加入20g活性炭，30℃搅拌30min后离心得固体24g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，60℃下真空(1.33kPa)干燥3h得63g干燥固体；④采用索氏提取法，加入189g二氯甲烷，回流2h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入5g正己烷重结晶，得0.54g多杀菌素产品，含量82.0％(液相色谱，外标；组分A77.3％，组分D4.7％)，收率79.5％。

[0039] 实施例9
[0040] ①在碱化釜中加入1000mL发酵液(含多杀菌素0.56g)，用20％NaOH溶液调节发酵液pH＝8，室温搅拌30min后离心得固体52g；②在一次离心后的水相中加入40g活性炭，
30℃搅拌30min后离心得固体45g，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥4h得83g干燥固体；④采用索氏提取法，加入252g三氯甲烷，回流3h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入6g石油醚重结晶，得0.55g多杀菌素产品，含量85.1％(液相色谱，外标；组分A80.1％，组分D5.0％)，收率83.7％。

[0041] 多杀菌素产品分析采用反相高效液相色谱法，分析条件为：高效液相色谱仪，带紫外检测器和色谱工作站或数据处理机；迪马C184.6×150mm/5μm，不锈钢柱；流动相：甲醇/乙腈/水＝20/70/10(v/v)；紫外检测器检测，波长245nm；多杀菌素标准品：已知含量≥90.4％；流速：1.50ml/min；柱温：40.0℃；进样量：20μl；定量方法：外标法；保留时间：多杀菌素A，7.3min；多杀菌素D，8.7min。

测定步骤：①标样溶液的配制：准确称取多杀菌素标样0.8g(精确至0.0001g)于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀。

再移取1ml 此溶液于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，备用；②试样溶液的配制：准确称取含多杀菌素纯样0.8g(精确至0.0001g)的样品于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

再移取1ml此溶液于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，备用；③测定：在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，得出各针的多杀菌素的峰面积。

待相邻两针的峰面积相对变化小于1.0％，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定；④计算：将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中多杀菌素的峰面积分别进行平均，多杀菌素质量百分含量X，按式(1)计算；⑤允许差：两次平行测定结果，相对误差应不大于1％，取其平均值作为报出结果。

[0042]
[0043] 式中:A1'-标样中多杀菌素峰面积的平均值；
[0044] A2，—试样中多杀菌素峰面积的平均值；
[0045] m1，—标样质量，g；
[0046] m2，—试样质量，g；
[0047] P—标样中多杀菌素的质量百分含量，％。