非标记型血小板衍生生长因子核酸适体传感器

非标记型血小板衍生生长因子核酸适体传感器
赵春玲;华梅;赵晓慧;黄亮亮;冯亚娟;牛司朋;符雪文;袁聪;杨云慧
【摘要】合成了介孔二氧化硅负载金纳米颗粒(Au-MSN),通过壳聚糖(CHIT)将Au-MSN固定到裸玻碳电极表面,采用自组装法将带巯基的血小板衍生生长因子(PDGF)核酸适体固定到Au-MSN修饰过的玻碳电极表面,制得PDGF核酸适体传感器.以亚甲基蓝作为电化学活性嵌入剂,通过检测核酸适体与目标分析物PDGF特异性结合前后亚甲基蓝电信号的变化,实现了对PDGF的定量检测.考察了缓冲溶液的pH、扫描速度及PDGF培育时间等条件对检测结果的影响.结果表明,在pH为7.6时,该传感器的检测范围为0.1pg/mL～1μg/mL,检出限为0.03 pg/mL.该传感器制作简单、成本低廉、灵敏度高且稳定性好.%Gold nanoparticles immobilized upon mesoporous silica ( Au-MSN) were synthesized. In the presence of chitosan(CHIT) , Au-MSN were immobilized on the surface of glassy carbon electrode. Then, the thiolated platelet-derived growth factor ( PDGF) aptamer was immobilized on the electrode surface via self-assembled technology. Using methylene blue as electroactive intercalator, the quantitative determination of PDGF was carried out based on the increase of electrical signal of methylene blue after the combination of aptamer with target PDGF. The effects of the pH of buffer, incubation time etc. on the signal of the electrode were investigated. The results showed that the biosensor exhibits excellent linear response to PDGF in the range of 0. 1 pg/mL—1μg/mL with a detection limit of 0. 03 pg/mL. This electrochemical aptasensor showed simplicity, low cost, high sensitivity and stability.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2013(034)001
【总页数】6页(P61-66)
【关键词】电化学;介孔二氧化硅;核酸适体;血小板衍生生长因子(PDGF);亚甲基蓝【作者】赵春玲;华梅;赵晓慧;黄亮亮;冯亚娟;牛司朋;符雪文;袁聪;杨云慧
【作者单位】云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500;云南师范大学化学化工学院,昆明650500
【正文语种】中文
【中图分类】O657.1
核酸适体(Aptamer)［1～3］是利用体外筛选技术指数富集配基系统进化技术(SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段．核酸适体能与多种目标物高特异性、高选择性地结合［4］．与抗体相比，核酸适体具有体外合成、选择性高、稳定性好且易于修饰等优点．基于核酸适体的电化学传感器在药物筛选、临床诊断及环境检测等方面具有广阔的应用前景［5］．核酸适体电化学生物传感器分为非标记型和标记型2种．标记型传感器的优点是灵敏度高，缺点是识别物需要标记，操作较繁琐．而非标记型传感器无需标记、操作简单、实时检测方便、假信号率低且对适体的活性没有损伤．
血小板衍生生长因子［6］(Platelet-derived growth factor，PDGF)是人体血小
板中具有双链结构的蛋白质生长因子，为促细胞分裂剂，可刺激成纤维细胞和其它多种细胞分裂增殖．其主要由巨核细胞合成，生理状态下主要储存在血小板的α
颗粒中，在骨骼和心脏等重要组织器官的病理、生理过程中发挥着重要作用［7］，引起了国内外学者的广泛关注．常见的PDGF检测方法有比色法、荧光法及电化
学方法等［8～10］．Wang等［10］通过静电吸附作用将电化学探针
［Ru(NH3)5Cl］2+固定在电极表面，利用金纳米粒子的信号放大效应实现了PDGF的高灵敏检测，检出限达0.01 pmol/L．Lai等［11］设计了一种用于直接检测血液中PDGF的电化学传感器，将末端修饰亚甲基蓝(MB)的PDGF核酸适体固定在金电极表面，此时核酸适体处于半折叠状态，电流信号较小;当核酸适体与
目标物结合后，MB与电极表面的距离缩短，电流信号变大．该Signal-on传感器在实际样品检测中显示出良好的稳定性，对血样和稀释血样中PDGF 的检出限分
别达到1 nmol/L 和50 pmol/L．Degefa等［12］以［Fe(CN)6］3－/4－为电
活性物质研制了非标记型PDGF核酸适体传感器，将核酸适体固定在金电极表面，当没有目标物时，核酸适体作为传感层处于一种活泼的结构，不影响电活性物质和电极间的电子传递;当与目标物结合之后，核酸适体折叠，紧密的结构阻碍了电子
传递，使电流减小，即Signal-off型．俞汝勤等［13～16］在该领域开展了一系
列创新性的工作，首次提出了滚环扩增效应(RCA)在电化学法检测蛋白质(如PDGF)方面的应用，并将实验数据与经典酶联免疫法(ELISA)数据进行比较，相对偏差很小，取得了一定的成果．
近年来，纳米材料的应用为发展高灵敏!高选择性的电化学生物传感器带来了新的
契机［17］．由于纳米材料具有比表面积大、生物活性中心多、吸附能力强及表
面亲水性等优异性质，研究者将其应用于生物传感器中，实现了生物活性物质与电极之间的直接电子转移，提高了电化学生物传感器的电信号响应灵敏度及稳定
性．目前，介孔硅纳米材料的制备方法和功能得到广泛研究［18］，为传感器的发展奠定了基础．本文基于多孔硅具有良好的吸附性能［19］、高比表面积、良好的化学稳定性和热稳定性以及低毒性等优点［20］，合成了介孔二氧化硅-金纳米颗粒(Au-MSN)，研制了非标记型PDGF核酸适体传感器．利用亚甲基蓝(MB)作为电化学活性嵌入剂，通过测量PDGF核酸适体与PDGF结合前后电化学活性物质电流的变化对PDGF进行测定．本方法的检出限低、检测范围广．
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
CHI660D电化学分析仪(上海辰华仪器公司);采用三电极体系:Au-MSN修饰的玻碳电极(GCE)为工作电极，饱和KCl甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极;Philips EM420型透射电子显微镜;TGL 16型离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)．
文中所用寡核苷酸序列:5'-
SH(C6)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCA TCACCATGATCCTG-3'购于宝生物工程(大连)有限公司;巯基乙醇(MCE)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正硅酸乙酯(TEOS)和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)均购于美国Sigma公司;氯金酸购于昆明铂锐金属材料有限公司;其它试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水．测定PDGF时所用的支持电解液为10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.60)缓冲溶液．
1．2 实验过程
1．2．1 介孔二氧化硅-金纳米颗粒的制备取1.00 g(2.74 mmol)CTAB溶解在280 mL超纯水中，加入3.5 mL NaOH(2 mol/L)溶液并加热至80℃．振荡下逐滴加入5.0 mL(22.4 mmol)TEOS，混合物反应2 h至产生白色沉淀，过滤，用超纯水和甲醇洗涤，高真空下干燥得到介孔二氧化硅(MSN)．为除去表面活性剂
CTAB，将合成的MSN在HCl-MeOH溶液(1.5 mL HCl溶解在150 mL MeOH 中)中回流6 h．产物经过滤，用超纯水和甲醇洗涤，高真空下于60℃干燥得到MSN．将MSN分散在甲醇溶液中，搅拌下加入HAuCl4/MeOH，再加入7 mL
甲醇和NaBH4/MeOH溶液，充分振荡至反应完全．将产物过滤，用甲醇洗涤，
在真空干燥箱中室温下干燥，得到的样品记为Au-MSN［21］．
1．2．2 核酸适体的配制根据核酸适体配制说明，用灭菌水配置2 μmol/L的PDGF核酸适体，再根据文献［10］方法用Tris-HCl配制含有1 mmol/L EDTA，10 mmol/L TCEP和0.1 mol/L NaCl的0.2 μmol/L PDGF核酸适体．
1．2．3 核酸适体传感器的制备将玻碳电极在金相砂纸上打磨，用 Al2O3悬浊液将电极表面抛光成镜面，再依次放入50%(体积分数)HNO3、无水乙醇和二次蒸馏水中各超声洗涤5 min．
取制备好的Au-MSN溶解在5 g/L壳聚糖(CHIT)溶液中，混合均匀后，移取10
μL该混合液滴在处理好的玻碳电极表面，过夜．
取10 μL 0.2 μmol/L的PDGF核酸适体涂在修饰有Au-MSN的电极上，过夜．将电极用Tris-HCl缓冲溶液洗涤，晾干后将10 μL 1 mmol/L的巯基乙醇滴
在电极上，等待1 h以封闭非特异性结合位点．用Tris-HCl缓冲溶液滴洗，制得
核酸适体传感器．电极不用时，置于4℃冰箱中保存．
1．2．4 实验原理及流程当核酸适体未与目标物PDGF结合时，处于一种相对自
由的状态;而当核酸适体与PDGF结合后，核酸适体构型变得紧凑［12］，在核酸适体折叠成双键的部位有MB嵌入，PDGF浓度越大，与核酸适体结合的数量越多，核酸适体折叠成双键的部位增多，导致嵌入的MB越多，电流就越大，即Signal-on型．通过测量不同PDGF浓度下MB的电流变化情况即可实现对PDGF含量的测定．实验流程见图1．
1．2．5 实验方法将制备的核酸适体传感器用Tris-HCl缓冲溶液清洗后，在传感
器表面上滴加10 μL不同浓度的PDGF样品液，于37℃下恒温培育75 min．Fig．1 Preparation procedure of PDGF aptasensor
采用差分脉冲伏安法(DPV)和循环伏安法(CV)对电活性嵌入剂亚甲基蓝的氧化峰进行测定．扫描参数:电位范围为－0.6～0 V，扫速为100 mV/s．交流阻抗(IMP)的测量是不同修饰阶段的电极在 5 mmol/L ［Fe(CN)6］3－/4－及 0.1 mol/L KCl 底液中进行的［13］．
2 结果与讨论
2．1 金-介孔二氧化硅纳米颗粒的形貌表征
电极材料对于电化学生物传感器的性能表现至关重要，它是传感器中生物分子的支撑材料，同时也是传感器的信号换能器［22］．纳米尺寸的材料往往展现出一些独特的物理化学性质，可用于提高传感器的性能．本文制备的介孔二氧化硅的多孔结构可以增大金纳米颗粒的负载量，提高巯基化核酸适体的负载量，从而提高传感器的灵敏度，降低传感器的检出限．由紫外-可见光谱图(图2)可见，Au-MSN在525 nm处有吸收峰，而单独的MSN则无吸收峰，说明金纳米颗粒已经负载到MSN上．从透射电镜图(图3)可以看出，介孔二氧化硅纳米材料介孔孔道结构清晰可见，负载的金纳米颗粒粒度均匀，分散性好，无团聚．
Fig．2 UV-Vis spectra of MSN(a)and Au-MSN(b)
Fig．3 TEM image of gold nanoparticles immobilized upon mesoporous silica
2．2 不同修饰电极界面的交流阻抗行为
电化学交流阻抗法常用于表征电极修饰过程中界面的变化［23］．图4为传感器制备过程中各界面在含5 mmol/L K3Fe(CN)6，5 mmol/L K4Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl混合溶液中的交流阻抗曲线．图4谱线a为裸玻碳电极的阻抗图，该曲线近似为一条直线，电阻很小，表明电子传递到电极表面只受扩散控制［24］;
谱线b为Au-MSN-CHIT复合膜修饰后的电极阻抗图，出现了较高的阻抗值(Ret=1000 Ω)，说明Au-MSN已修饰到电极表面，阻碍了电子的传递;谱线c为aptamer/Au-MSN-CHIT复合膜修饰后的电极界面的阻抗图(Ret=1300 Ω)，电阻进一步增大，说明核酸适体已成功固定到电极表面;谱线d为
PDGF/MCH/aptamer/Au-MSN-CHIT复合膜修饰后的电极界面的阻抗图，可见抗阻值剧增(Ret=3600 Ω)，表明PDGF已与电极表面的核酸适体结合．
Fig．4 Nyquist plots of impedance spectra obtained in 5 mmol/L
［Fe(CN)6］3－/4－a．Bare GCE;b．Au-MSN-CHIT/GCE;c．aptamer/Au-MSN-CHIT/GCE;d．PDGF/MCH/aptamer/Au-MSN-CHIT/GCE．
2．3 检测条件的优化
2．3．1 扫描速度对电极响应电流的影响改变不同的扫描速度，考察了MB在传感器上的循环伏安行为，结果见图5．从图5插图可见，氧化还原电流与扫描速度的平方根(v1/2)呈线性相关，说明此过程受扩散控制．
2．3．2 pH对 PDGF测定的影响考察了 pH为6.8～8.0时传感器的电流值(图6)．结果表明，在pH为7.6时电极的响应较好，故选用pH为7.6的Tris-HCl缓冲溶液为溶剂配成的MB溶液作为测试底液．
2．3．3 PDGF培育时间对电极性能的影响考察了PDGF培育时间对电极响应的影响．由图7可见，当培育时间为75 min时，电流值最大，电极的响应性能最好．因此选择75 min作为PDGF的培育时间．
Fig．5 CV curves of the electrode in MB solutionScan rates from inner to outer curves were:20，40，60，80，100，120 mV/s，respectively．The inset shows linearity of peak current vs．v1/2．
Fig．6 Effect of pH on the response of aptasensor
Fig．7 Effect of the cultivate time of PDGF on the response of aptasensor
2．4 电化学核酸适体传感器响应性能
图8为电化学核酸适体传感器在不同浓度的PDGF溶液中的校正曲线，电流值与PDGF浓度的对数在0.1 pg/mL～1 μg/mL之间呈良好的线性关系，线性方程为
I=0.4295lgc+12.34(c:ng/mL)，相关系数达0.9514．根据3σ规则，PDGF的检
出限为0.03 pg/mL．
Fig．8 Calibration curves of aptasensor in different PDGF concentrations Fig．9 Possible interferences tested with biosensora is 1 μg/mL PDGF，interference s from curve b to e were 40 μg/mL glutamic acid，40 μg/mL uric acid，40 μg/mL ascorbic acid and 40 μg/mL glucose，respectively．2．5 抗干扰试验
在相同的测试条件下，选择人体中可能的干扰物如抗坏血酸、尿酸和葡萄糖等考察了PDGF核酸适体传感器的抗干扰情况．从图9可见，以上物质对PDGF的测定
无明显的干扰，说明此传感器具有良好的抗干扰性能．
2．6 传感器的重现性及稳定性
采用该传感器对1 μg/mL的PDGF样品连续测定5次，相对标准偏差仅为4.0%，说明该传感器对PDGF的测定有较好的重现性．
经过连续200圈的CV扫描(图10)，传感器峰电流值仅下降2.9%，说明该传感器具有很好的稳定性．传感器不用时保存在4℃的Tris-HCl缓冲溶液中即可．
2．7 回收率的测定
采用该传感器进行PDGF回收率的测定，在10 mL MB溶液中加入10 μL正常人的血清作为测定背景，结果列于表1．由表1可见，回收结果较好，说明该传感器对于PDGF的实际测定有一定的可行性．
Table 1 Recov ery determination of PDGFAdded/(ng·mL－1) Found/(ng·mL
－1) Recovery(%) Average recovery(%)0．5 0．483 96．60 93．14 5 4．581
91．62 500 456 91．20
Fig．10 Stability of the prepared aptasensor
3 结论
通过自组装技术将PDGF核酸适体固定在介孔二氧化硅负载金纳米颗粒(Au-MSN)和CHIT修饰过的玻碳电极表面，以电化学活性嵌入剂MB为检测探针，研制了一种新的非标记型PDGF核酸适体传感器．该传感器具有稳定性好、灵敏度高、检
出限低及检测浓度范围广等优点．
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