碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的表型和基因型分析

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的表型和基因型分析
李岷;魏源华;史恒芳;曹慧玲
【摘要】目的研究本院碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌的表型和基因型.方法用
纸片扩散法进行药物敏感试验,改良Hodge试验和EDTA协同试验检测耐药表型,
设计通用引物行PCR检测KPC、IMP、VIM、NDM-1和OXA-23耐药基因,并测序分析.结果 14株肺炎克雷伯菌呈现高度耐药性,有13株携带KPC-2基因,1株携
带IMP-4基因,未检测出VIM、NDM-1和OXA-23基因.结论本院产碳青霉烯酶
的肺炎克雷伯菌主要为KPC-2和IMP-4基因型.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2012(030)008
【总页数】2页(P623-624)
【关键词】碳青霉烯酶;肺炎克雷伯菌;通用引物;KPC-2;IMP-4
【作者】李岷;魏源华;史恒芳;曹慧玲
【作者单位】江苏省中医院检验科,南京210029;江苏省中医院检验科,南京210029;江苏省中医院检验科,南京210029;江苏省中医院检验科,南京210029
【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
碳青霉烯酶是一类强大的β-内酰胺酶，几乎能耐受所有临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂的作用[1]。

随着亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，
肠杆菌科细菌对此类抗菌药物的耐药表现越来越普遍。

我院自2010年发现首株泛耐药的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)后，目前已发现20余株泛耐
药的肠杆菌科细菌，其中大部分为Kpn。

本研究对2010年3月至2011年5月
本院分离的14株耐碳青霉烯类抗生素的泛耐药Kpn进行了耐药表型和基因型的
分析，报道如下。

1 材料与方法
1.1 菌株来源 2010年3月至2011年5月从本院住院患者的血液、尿液和痰液等标本中分离出的14株耐碳青霉烯类的泛耐药Kpn，已剔除同一患者相同部位的重复菌株。

经法国Bio Mérieux公司Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定。

质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.2 试剂和抗菌药物 90 mm M-H琼脂培养基(郑州安图绿科公司)；哌拉西林(PIP)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、头孢西丁(FOX)、头孢呋辛(CXM)、头孢他啶(CAZ)、头
孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、头孢吡肟(FEP)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、氨曲南(ATM)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、复方磺胺甲噁唑(SXT)药敏纸片及空白纸片(英国Oxoid公司)。

PCR检测相关试剂(大连宝生物工程公司)。

7500型PCR仪(美国ABI公司)，凝胶成像系统(Kodak
公司)。

1.3 纸片扩散法药敏试验依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI) 2010版
(M100-S20)的操作及折点要求进行测定和结果判断。

1.4 改良Hodge试验(MHT)[2] 按照CLSI 2010版(M100-S20)的标准操作规程操作。

1.5 产金属β-内酰胺酶检测 EDTA协同试验按照Noyal等[3]报道的IPM、EDTA
双纸片法进行。

1.6 PCR扩增与测序根据GenBank序列，设计能测序区分KPC、IMP、VIM以
及NDM-1和OXA-23的5对通用引物，由上海英骏公司合成，引物序列、产物
长度及退火温度见表1。

采用煮沸法提取DNA 模板，反应体系均为25 μL。

取5 μL PCR产物经含溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

阳性
结果送上海英骏公司双向测序。

测序结果经BLAST比对分析，以明确耐药基因类型。

表1 耐药基因PCR扩增引物基因引物序列(5′→3′)扩增片段长度(bp)退火温度(℃)KPCF：TCTGGACCGCTGGGAGCTGG39962R：TGCCCGTTGACGCCCAATCCOXA⁃23F：ATTTTACTTGCTATGTGGTT⁃GCT75554R：CGGCATTTCTGACCGCATTVIMF：TTACCAGATTGCCGATGGTGT52060R：CCATTCAGCCAGATCGGCATIMPF：GAGTGGCTTAATTCTC36448R：GTTTCAAGAGTGATGCNDM⁃1F：GTGCCGTCGATCCCAAC38260R：CTTCCAACGGTTTGATCGTC
2 结果
2.1 药敏试验结果 14株Kpn对青霉素类和头孢类抗生素均耐药；12株对SXT敏感，抑菌圈直径为16～23 mm。

仅1株细菌(编号a)对氨基糖苷类抗生素
GEN(抑菌圈直径为17 mm)、喹诺酮类抗生素CIP和LVX(抑菌圈直径为18 mm
和19 mm)敏感，并对碳青酶烯类抗生素IPM、MEM敏感和中介(抑菌圈直径为
18 mm和14 mm)，其余细菌均耐药。

2.2 碳青霉烯酶筛查结果14株泛耐药Kpn MHT均为阳性，提示均产碳青霉烯酶。

2.3 金属酶筛选结果 14株泛耐药肺炎克雷伯菌中仅a号菌株金属酶筛查阳性，均
为阴性。

2.4 PCR扩增和测序结果 14株Kpn中有13株KPC基因阳性，经测序后BLAST
比对发现均为KPC-2基因(GenBank号AY034847)。

a号Kpn的KPC基因为阴
性，而IMP基因阳性，经测序后BLAST比对，发现为IMP-4基因(GenBank号AF244145.1)。

其余VIM、NDM-1和OXA-23基因PCR扩增均为阴性。

见图1。

注：M，DNA marker；1，a号菌KPC基因扩增阴性；2，KPC扩增阳性(399 bp)；3，a号菌IMP基因扩增阳性(364 bp)；4，空白对照。

图1 PCR扩增产物
琼脂糖凝胶电泳图
3 讨论
基于氨基酸的同源性，碳青霉烯酶可分成4类(A、B、C和D)。

A、C和D类指其活力位点含有丝氨酸的β-内酰胺酶，而B类β-内酰胺酶是有一个锌活性位点的金属酶。

KPC-2属于A类碳青霉烯酶。

IMP为B类碳青霉烯酶，不能被克拉维酸抑制。

国内陆续报道了产KPC-2型耐碳青霉烯类抗生素的Kpn[4-5]。

本研究选择的14
株Kpn均为产碳青霉烯酶的泛耐药菌。

其中13株产KPC-2的Kpn对喹诺酮类和氨基糖苷类等抗生素高度耐药，而仅有的1株产IMP-4的Kpn对喹诺酮类和氨基糖苷类药物敏感。

高水平耐药的原因多为产碳青霉烯酶且合并了其他耐药机制，特别是外膜通透性改变[6]。

因此，本研究的耐药表型提示，产KPC-2的Kpn可能
合并了膜孔蛋白Omp36等的缺失，导致了13株肺炎克雷伯菌的高度耐药性。

而产IMP-4的Kpn可能并未合并膜孔蛋白的突变缺失，使得其对喹诺酮类和碳青酶烯类有一定的敏感性。

14株Kpn有12株对SXT显示出敏感性，这提示对于耐碳青霉烯类抗生素的Kpn，SXT可能是临床有效的抗菌药物，但尚未见文献报道，
其机制也待研究。

4 参考文献
[1]Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases[J]. Clin Microbiol Rev, 2007, 20(3):440-458.
[2]施德仕, 邵海枫, 王卫萍, 等. 用改良Hodge试验筛查低产碳青霉烯酶肠杆菌科
细菌[J]. 临床检验杂志, 2010,28(6):455-458.
[3]Noyal MJ, Menezes GA, Harish BN, et al. Simple screening tests for detection of carbapenemases in clinical isolates of nonfermentative gram-negative bacteria[J]. Indian J Med Res, 2009, 129(6):707-712.
[4]Wei ZQ, Du XX, Yu YS, et al. Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumoniae isolate from China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(2): 763-765.
[5]蒯守刚,邵海枫,王卫萍，等. 肺炎克雷伯菌介导碳青霉烯类耐药的基因型检测[J]. 临床检验杂志,2008,26(5):358-361.
[6]Davies J, Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2010, 74(3):417-433.。