生物技术药物的生物学活性测定

生物技术药物的生物学活性测定
生物技术药物
1、生物技术：基因工程、细胞工程、发酵工程、酶
工程
2、生物技术药物：细胞因子、抗体、疫苗、寡核苷
酸药物、基因治疗药物等
3、临床应用：预防、治疗、诊断
肿瘤、心血管疾病、遗传病、神经系统疾病、传
染病、哮喘、伤口愈合等
生物技术药物的特点
1生物技术药物与化学药物性质不同——
化学本质为蛋白质、多肽、核酸等
蛋白质四级结构示意图
生物技术药物的特点
2活性由产品的高级结构决定——
质量数不能反映产品的药效学和生物学活性
3影响活性因素：
表达体系——大肠杆菌、酵母、哺乳动物，是否
糖基化
纯化方案——尤其是包含体变性、复性过程
冻干工艺——
生物技术药物质量标准的要求
1保证药物的安全性、有效性和质量可控；
2活性（效力）的测定是保障产品有效性的最重要指标之一，是考察产品全面特征的重要步骤：
重组细胞因子—生物学活性(效价)测定
3在原液和成品检定中，生物学活性测定都是重要指标；
生物学活性测定
——体内和体外均可以进行；
——获得的结果在一定程度上依赖于采用的方法；
——几乎所有的生物活性测定都是比较分析实验，
需要标准品或参考品；
——不一定直接反映产品的临床适应症，但要能够
准确测定产品效价、评价产品稳定性与批间一
致性
生物学活性测定的几种主要方法
1体内测定法----
整体测定，利用动物体内某些指标的变化；
2离体动物器官测定法----
3生化酶促反应测定法----
不依赖于活的生物系统，主要基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应
生物学活性测定的几种主要方法
4免疫学活性测定法——
利用蛋白对异种动物有相应的免疫原性，制备抗体，然后通过
E L I S A测定含量。

5体外细胞培养测定法——
促进细胞生长、抑制细胞生长、间接保护细胞作用
体外细胞培养测定法
1、促进细胞增殖——
a)促进某种细胞的生长，但不依赖：
3T3细胞/E G F、b F G F
b)是某种细胞生长的依赖因子：
T F-1/G M-C S F、N F S-60/G-C S F、C T L L-2/I L-2
2、抑制细胞增殖——L929/T N F
3、间接保护细胞作用——I F N/W I S H-V S V
测定方法的选择
1传代细胞（因子依赖细胞>非因子依赖细胞）
>原代细胞>离体器官>体内测定法
2定量方法>半定量方法>定性方法
生物学活性和比活性
●生物学活性——
每m l或每支待测样品中含有的生物学活性单位，
U或I U或A U/m l(支)
●比活性——主要针对原液或原料药
每单位质量(m g)蛋白质中含有的特定生物学活性单位，U/m g或I U/m g或
A U/m g
●比活性(U o r I U/m g)=
生物学活性(U o r I U/m l)/蛋白质浓度(m g/m l)
生物学活性测定标准范围的确定
不同测定方法的规定标准不同：
1、80-150%——如I F N、G M-C S F、G-C S F等
细胞因子依赖、抑制细胞生长或
直接杀死细胞
2、70-200%——如E G F、b F G F等
剂量-反应曲线不特别陡峭
标准品（参考品）的作用
1、所用试剂或培养基的配制、纯度、灵敏度不同；
2、细胞系代次或来源不同；
3、试验动物的品系和健康状况；
4、不同实验室、不同试验人员、不同试验时间
统一尺度、最大限度地消除误差，从而获得一致
的结果；
生物学活性测定需要的条件
（以细胞为基础的活性测定）
1、细胞培养所需要的全部条件
2、活性测定用标准品或参考品
3、酶标仪及软件分析系统
细胞培养的基本概念
1、细胞系和细胞株
2、传代
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。

3、原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

培养细胞的生长方式
1）贴壁生长：3T3，M C F-7，W I S H
2）悬浮生长：H L-60，7T D1，T F-1，N F S-60
细胞生长曲线
细胞生长的条件
1、无污染环境
2、细胞生存环境
¡ª¡ª温度:37℃，39℃很快死亡
¡ª¡ª气体环境和氢离子浓度：O2
¡ª¡ªC O2:5%或10％C O2+H2O←→H2C O3←→H++H C O3-
¡ª¡ªp H:7.2-7.4
¡ª¡ª渗透压
3、培养基
常用合成培养基
1、M E M(m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m)
2、D M E M（D u l b e c c o’s m o d i f i e d E a g l e m e d i u m):高糖和低糖之分（1000和4500m g/L的葡萄糖）
3、R P M I1640
4、199、F12、S F12等
配制时要注意：水、碳酸氢钠、p H值、渗透压、
L-谷胺酰胺
血清和抗生素
1、血清：牛血清(F B S,f e t a l b o v i n e s e r u m;F C S不
准确）、马血清(H S)
无支原体，无菌，需经促增殖试验验证
5-20%
2抗生素：双抗（青霉素+链霉素）、庆大霉素
消化液
1、胰蛋白酶溶液：0.25%或0.125%
L y s-A r g、粘蛋白和糖蛋白、细胞骨架
2、E D T A溶液：0.53m M
3、0.25%(w/v)T r y p s i n-0.53m M E D T A
细胞计数
血细胞计数器：
（A+B+C+D）/4X104X稀释倍数=细胞数/m l
《中国药典》三部收录的
重组产品的生物学活性测定体系
干扰素概述
1、最早发现的细胞因子，因具有干扰病毒复制的作用而得名；
2、I F N包括I F Nα1b，α2b，α2a，β，γ，ω
3、I F N生物学活性测定方法：用细胞株检测、用基因工程技术检测、细
胞病变抑制法（即C P E法，为国际标准I F N测定法）
实验原理
——I F N能刺激某些指示细胞(如W i s h、H e p-2
及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋
白，从而使细胞免受V S V病毒的攻击。

——用结晶紫对活细胞进行染色，通过光吸收值计
算活细胞数，然后根据待测样品不同稀释
度的保护能力，计算干扰素生物学活性。

结晶紫染色法
——结晶紫为一种碱性染料，可以使细胞膜染
色，染色后洗去结晶紫染液可以测定光吸收
值，光吸收值与染色细胞数成正比；
——该染色方法简单易行，适合贴壁细胞的量反
应测定；
——不同国家采用不同的活性测定细胞：W I S H细胞-V S V病毒；
W I S H细胞
I F N生物学活性测定曲线
M T T比色法原理
——M T T：四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-d i m c t h y l t h i o a z o l-2-y l)-2，5-d i p h e n y l-t e t r a z o l i u m
b r o m i d e)
——活细胞的线粒体内的琥珀酸脱氢酶可代谢M T T等四唑盐类物质（如X T T、W S T-1），还原为紫色的结晶状的物质f o r m a z e n，沉积在细胞周围，用D M S O溶解后，通过酶标仪读取光吸收值，检测细胞增殖状态。

——一般情况下，f o r m a z e n的量与活细胞数相一致，因此吸光度值的大小间接反映存活的细胞数量。

E G F概述
1、20世纪60年代从小鼠颌下腺中提取出的小分子蛋白；
2、人和鼠的E G F都只有53个氨基酸，无糖基化位点，3对二硫键，无α-h e l i x；
3、临床用途：烧伤、烫伤、角膜损伤、糖尿病引起的脚趾溃疡等
B A L B/C3T3细胞
G M-C S F的概述
——G M-C S F是分子量为22k D的糖蛋白，含127个氨基酸残基。

由于可以刺激造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落而命名。

——可以作用于造血干细胞，促进其分化增殖，如单核－巨噬细胞增殖，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和巨核细胞。

——还能刺激多能干细胞和早期红细胞的增殖和分化。

G M-C S F的概述
——临床应用：
A.预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症。

B.治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征。

C.预防白细胞减少可能潜在的感染并发症。

D.使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。

T F-1细胞
G M-C S F生物学活性曲线
用E X C E L作图结果
实验结果的计算
——数据用S O F T M A X软件分析
四参数方程式：y=((A-D)/(1+(X/C)^B))+D
——对各实验样品的光吸收值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序或E X C E L进行处理。

——分别计算各实验样品的半效稀释倍数，即从样本溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数，并按下式计算实验结果：
实验结果的计算
待检样品效价=
标准品效价X
待检样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数X
待检样品半效稀释倍数/标准品半效稀释倍数
实验结果的计算
——如果曲线发生了平移或平行性关系不好：
应当重新调整稀释倍数；
——当标准品曲线与待检样品曲线完全重合时，
测定结果最为准确；
——原始数据的选择：最多删除2个点，不能删除一个稀释度
生物学活性测定的关键步骤
1、掌握无菌操作基本技术，避免污染；
2、良好的细胞状态：细胞形态、培养时间；
3、样品预稀释和稀释倍数的选择；
4、标准品（参考品）的剂量-反应曲线。

样品在96孔细胞培养板上的排列
谢谢！。