气相色谱—质谱分析5种雌激素类物质的衍生化方法优化

气相色谱—质谱分析5种雌激素类物质的衍生化方法优化王欣;顾弘理;沈剑;仝欣楠;王欣泽
【摘要】选取5种雌激素类物质雌酮(E1)、雌二醇(E2)、17α-雌二醇(EE2)、雌三醇(E3)、双酚A(BPA)为研究对象,在气相色谱(GC)—质谱(MS)联用分析方法的基础上,对衍生化试剂和衍生化反应条件进行了优化.结果表明,使用含有1％(质量分数)三甲基氯硅烷(TMCS)的N,O-双(三甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺(BSTFA)联合吡啶作为衍生化试剂,加热条件为烘箱70℃加热40min时,衍生化产物单一且灵敏度高.采用此优化方法得到5种物质的平均加标回收率为98.0％～104.3％,相对标准偏差(RSD)为0.4％～12.5％,可为环境中5种雌激素类物质的分析测定提供参考.
【期刊名称】《环境污染与防治》
【年(卷),期】2018(040)008
【总页数】6页(P890-895)
【关键词】雌激素;衍生化;烘箱加热;气相色谱—质谱
【作者】王欣;顾弘理;沈剑;仝欣楠;王欣泽
【作者单位】上海交通大学环境科学与工程学院,上海 201100;上海交通大学环境科学与工程学院,上海 201100;上海交通大学环境科学与工程学院,上海 201100;上海交通大学环境科学与工程学院,上海 201100;上海交通大学环境科学与工程学院,上海 201100
【正文语种】中文
在过去的二十多年中，内分泌干扰物被列为环境中最常见的有机物之一[1]2549。

环境中雌激素类物质作为一种内分泌干扰物，可以干扰生物体内激素的合成、代谢、转运、键合能力，甚至对其具有清除作用[2]。

常见的雌激素类物质如雌酮(E1)、
雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-雌二醇(EE2)和双酚A(BPA)等虽然在环境中浓度极低，但也能干扰内分泌系统，对动物和人体造成潜在或显著的危害[3-6]。

目前对
雌激素类物质的常用分析方法是气相色谱(GC)—质谱(MS)联用方法，该方法分离
效果好，准确性和灵敏度高，能检测分析不同环境介质中不同种类的内分泌干扰物[7-10]。

上述5种雌激素类物质含有至少一个羟基官能团，极性较大，直接进GC—MS分析会导致检测灵敏度和结果的可靠性降低[11-12],[13]249。

衍生化可以通过改变
官能团结构降低分析物极性，提高其挥发性和热稳定性，从而提升色谱分离效果和灵敏度[14]212。

最常见的衍生化技术是甲基硅烷化，通常使用N,O-双(三甲基甲
硅烷基)-三氟乙酰胺(BSTFA)或N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA)
作为衍生化试剂，用较少极性的四甲基硅烷(TMS)基团代替活性羟基[15]。

衍生化反应加热方法通常包括水浴、沙浴和微波炉等[13]251,[14]212,[16]。

不同衍生化
方法在灵敏度、时间和可靠性方面存在较大差异，因此选出一种优化的方法就具有重要意义[1]2550。

本研究选取了5种雌激素类物质：E1、E2、E3、EE2和BPA作为研究对象，系统地优化了衍生化试剂、加热方式与时间。

此外，本研究提出一种新的加热方式即烘箱加热法，取得了良好的衍生化结果。

优化后的方法有助于提高GC—MS的检测灵敏度和分析检测效率，对雌激素类物质的分析测定具有参考意义。

1 材料与方法
1.1 化学试剂
E1、E2、EE2、E3、BPA和灭蚁灵(MX)均为分析标准品，甲醇、正己烷、MSTFA、三甲基硅烷咪唑(TMSI)、二硫赤藓糖醇(DTE)、吡啶和含有1%(质量分数，下同)
三甲基氯硅烷(TMCS)的BSTFA试剂(记为BSTFA(1% TMCS))均为色谱纯。

分别将5种标准物质溶于甲醇溶液，配制成1 g/L的母溶液。

使用前将其稀释，
现配现用。

将MX溶于正己烷溶液配制成1 mg/L的内标溶液。

MSTFA衍生化试剂是由TMSI和DTE按照比例MSTFA∶TMSI∶DTE为5 mL∶10 μL∶10 mg加
入到MSTFA中溶解配制而成。

标准溶液和衍生化试剂分别放置于-20 ℃和4 ℃，密封避光保存。

1.2 衍生化步骤
取混合标准溶液于2 mL棕色样品瓶中，用温和的高纯度氮气流将样品吹干。

吹至完全干燥后，加入一定量的衍生化试剂于样品瓶中并盖好密封。

经过一段时间的加热，用氮气吹至全干，加入1 mL内标液MX，进行GC—MS分析，具体衍生化
步骤如图1所示。

1.3 GC—MS分析
GC—MS分析仪器购于美国Thermo Fisher公司，具体型号为：TRACE1300 GC，ISQ Series Quadrupole MS和Triplus RSH自动进样器。

自动进样器每次取样1 μL，随后进入GC进行分离。

所使用的色谱柱为美国制造的TG-SQC毛细管柱，
尺寸为15 m×0.25 mm×0.25 μm，最大柱流失测试温度为330 ℃，最高操作温
度350 ℃，载气氦气流速保持在1.0 mL/min。

MS以电子轰击离子源作为离子化技术，先使用全扫模式进行物质定性，再使用选择性离子扫描模式(SIM)进行定量
分析。

炉箱升温方式为程序升温，具体升温程序为：初始温度50 ℃维持2 min，再以20 ℃/min的速率升温至280 ℃，最后保持10 min，整体升温时间为21 min。

离子源温度为250 ℃，MS传输线温度为280 ℃。

使用Xcalibur软件进行数据分析，该软件通过对仪器和数据方法的设置，可以实
现对分析物定性和定量结果的分析。

2 结果与分析
2.1 5种雌激素类物质的衍生化产物
本实验所选取的5种物质基本信息如表1所示。

硅烷化是最常见的用于衍生化含活性氢原子有机化合物的方法，通过甲硅烷基取代活性氢原子，可降低待分析物的极性，提高热稳定性[17]。

硅烷化的另一个重要优点是能够产生更有利的分析碎片模式，提升MS分析特性。

其反应方程式如下：—XH+ASiR1R2R3→—XSiR1R2R3+AH
(1)
式中：—XH为—OH、=NH、—NH2、—COOH等活性基团，X为除活性氢原
子之外的结构；ASiR1R2R3 为硅烷化试剂，A为有机官能团，R1R2R3为甲硅烷
基基团[18]。

图1 5种雌激素类物质的衍生化步骤Fig.1 The derivatization steps of five kinds of estrogens表1 5种雌激素类物质的基本信息和结构Table 1 Characteristics and structures of five kinds of estrogens
项目CAS号分子式分子量化学结构E153-16-7C18H22O2270E250-28-
2C18H24O2272EE257-63-6C20H24O2296E350-27-1C18H24O3288BPA80-05-7C15H16O2228
5种物质经过烷基硅烷化反应，羟基中的氢原子被硅烷基取代生成TMS物质[19]。

其中BPA、E1、E1、E3分别被衍生化生成bis-TMS-BPA、mono-TMS-E1、di-TMS-E2和tri-TMS-E3。

而EE2的衍生物并非单一，包括只有一个羟基被取代的mono-TMS-EE2和两个羟基完全被取代的di-TMS-EE2等。

出现这种情况的可能原因是受到EE2羟基附近的三键的影响，也有可能是由于EE2衍生物的转化以及
反应条件有利于生成mono-TMS-EE2[20],[21]122。

表2提供了6种衍生物和内
标物的保留时间(RT)和特征离子信息，图2提供了这7种分析物的结构图。

表2 衍生物和内标物的RT和特征离子Table 2 Characteristic ions and RT of derivatives and internal standard衍生物RT/min分子量特征离子质荷比bis-TMS-BPA11.36372357、372MX12.86540272、237mono-TMS-
E113.12342257、218、285di-TMS-E213.28416285、326mono-TMS-
EE213.44368285、232di-TMS-EE213.72440425、285tri-TMS-
E314.12504311、345
2.2 不同衍生化试剂衍生化效果的比较
衍生化试剂种类、加热方式和时间对衍生化效果有很大影响，优化衍生化方法指综合3方面选出一种最优化的组合方式[22]。

使用了3种硅烷化试剂：MSTFA、BSTFA(1% TMCS)、BSTFA(1% TMCS)+吡啶，每种衍生化试剂选取一组不同浓
度的标准溶液进行多次实验，以减少实验误差。

图3对3种衍生化试剂的效果进
行了比较。

BSTFA作为衍生化试剂能够快速地与含羟基的化合物发生反应，生成稳定可溶性
的衍生物质。

一些学者将BSTFA与TMCS混合以提高反应产率，研究了在混合物中添加质量分数为0.25%～15.00%的TMCS对结果的影响，结论表明最佳质量比为BSTFA∶TMCS=99∶1[23]。

由图4可以看出，使用BSTFA(1% TMCS)作为衍生化试剂，6种物质峰形良好且分离效果明显。

其中EE2衍生化生成两种衍生物：mono-TMS-EE2(RT=13.44 min)和di-TMS-EE2 (RT=13.72 min)，对EE2定量
分析的准确性产生影响。

BSTFA及其衍生化产物(包括mono-TMS-EE2和di-TMS-EE2)具有高挥发性，因此早期洗脱峰几乎没有干扰。

MSTFA与其他TMS供体也具有相似的反应性质，
但由于MSTFA本身及其衍生化产物N-甲基三氟乙酰胺的挥发性较高，故具有优
于BSTFA和其他TMS试剂的优势[21]122。

从图5可以看出，MSTFA衍生EE2
时仅生成di-TMS-EE2(RT=13.72 min)，峰形尖锐且分离程度高，其峰面积比在3种衍生化试剂中最高(见图3)，表明MSTFA对EE2的衍生化效果最好。

图2 衍生物和内标物的结构图Fig.2 Structures of derivatives and internal standard
图3 不同衍生化试剂对5种物质的衍生化效果比较Fig.3 Comparison of five kinds of estrogen derivatization efficiency of various reagents
图4 BSTFA(1% TMCS)试剂衍生化物质MS图Fig.4 MS spectra of BSTFA (1% TMCS)- derivatized compounds
图5 MSTFA试剂衍生化物质MS图Fig.5 MS spectra of MSTFA-derivatized compounds
为解决BSTFA(1% TMCS)衍生化造成多种EE2衍生物的弊端，研究人员尝试向BSTFA(1% TMCS)试剂中添加吡啶。

实验结果表明，当50 μL吡啶与50 μL BSTFA(1% TMCS)试剂一同作为衍生化试剂时，EE2仅衍生生成di-TMS-
EE2(RT=13.72 min)，并未发现有mono-TMS-EE2等其他衍生物，其衍生化物质MS图如图6所示。

吡啶作为催化剂，一方面可以加速衍生化试剂的反应，同时它又可作为一种酸清理剂，去除衍生化过程中产生的氢离子，保护GC色谱柱[21]126。

由图3可以得知，添加吡啶后，5种分析物的峰面积比相对于未添加时增加了33.80%～282.66%。

虽然MSTFA对EE2的衍生化效果最好，其EE2衍生物的峰面积比相对于BSTFA(1% TMCS)+吡啶增加了5.87%，但对于除EE2之外的其余4种分析物而言，BSTFA(1% TMCS)+吡啶试剂的峰面积比相对于MSTFA增加了4.01%～33.47%。

因此，BSTFA(1% TMCS)+吡啶是最佳的衍生化试剂。

图6 BSTFA(1% TMCS)+吡啶试剂衍生化物质MS图Fig.6 MS spectra of BSTFA (1% TMCS) with pyridine-derivatized compounds
2.3 不同加热方式衍生化效果的比较
采用了4种不同的加热方式：70 ℃水浴加热40 min，干燥烘箱70 ℃加热40 min，微波炉350 W加热2 min以及微波炉700 W加热1 min，衍生化试剂均
选用BSTFA(1% TMCS)+吡啶。

每种加热方式选取一组不同浓度的标准溶液进行
多次实验，以减少实验误差。

水浴加热作为传统的加热方式操作简单，应用范围广。

本次预实验表明，水浴加热的最佳条件是70 ℃加热40 min。

过高的温度或者过长的时间对于检测效果的提
升并没有太大效果[14]212。

为减少加热时间，提高衍生化反应效率，众多学者对微波加热的方式展开了研究[24-27]。

就热传递方式而言，不管是通过干燥烘箱加
热还是水浴加热，热量都是从热源传递至样品瓶再由样品瓶传递至样品用于衍生化反应。

这种普通的加热方式热量通过样品瓶传播，速度比较慢；而微波加热的方式，主要原理是基于雌激素类物质、衍生化试剂和其他溶液对于微波辐射的吸收，通过分子间的偶极旋转和离子传导作用减少反应时间[14]214。

如图7所示，对于5种物质的衍生化，微波700 W加热1 min、微波350 W加
热2 min和水浴加热3种方式的峰面积比几乎相同，3者衍生化效果差别不大，
表明这2种微波加热方式对雌激素类物质的衍生效果并没有明显的提高，但是能
大幅度缩短加热时间，从而提高实验效率。

图7 不同加热方式对5种物质的衍生化效果比较Fig.7 Comparison of five kinds of estrogen derivatization efficiency of various heating ways
从图7可以进一步看出，烘箱70 ℃加热40 min对5种待测物质的衍生化效果最好，其峰面积比相比微波350 W加热2 min增加了35.97%～87.90%。

硅烷化试剂及其衍生化产物对湿度敏感，因此常需要采取密封措施以防止水蒸气致其失活[21]122。

采用烘箱加热的方式则有效避免了水蒸气的干扰。

另一方面，烘箱提供的热源稳定，可以精确调节温度。

目前烘箱加热的方式普遍应用于土壤有机质、有
机碳及化学需氧量等指标的测定，鲜有研究用于衍生化反应，因此具有良好的应用前景[28-30]。

从上述衍生化优化的实验可以得出结论：使用50 μL BSTFA(1% TMCS)+50 μL 吡啶作为衍生化试剂，在烘箱70 ℃加热40 min的加热条件下进行衍生化反应，样品经过GC—MS分析得到的分析效果最好。

表3是采用该优化组合分析5种物质的线性方程及相关信息，线性方程线性关系良好，R2均大于0.99。

为考察方法的准确度和精密度，以含有450 ng被测组分的混合标准溶液为样品，在1 d内测定7次,E1、E2、EE2、E3和BPA的平均加标回收率分别为104.3%、98.5%、98.4%、98.4%和98.0%，相对标准偏差(RSD)分别为0.6%～12.5%、0.8%～5.5%、1.5%～10.6%、2.3%～6.7%、0.4%～6.8%。

结果表明该方法准确度高，精密度好，满足分析要求。

表3 优化后衍生化方法衍生5种物质的线性方程1)Table 3 Linear equations of five kinds of estrogens using the optimized derivatization method分析物线性方程R2分析物质量浓度/(μg·mL-1)E1Y=-0.226 226+0.736 635X0.998 20.45～3.60E2Y=-0.601 909+1.731 95X0.996 20.45～3.60EE2Y=-0.204
649+0.512 688X0.991 30.45～3.60E3Y=-0.350 032+0.898 027X0.994
30.45～3.60BPAY=-1.533 3+4.270 9X0.995 40.45～3.60
注：1)X为所加入标准物质质量，μg；Y为峰面积比。

3 结论
(1) 使用BSTFA(1% TMCS)试剂衍生EE2会生成mono-TMS-EE2和di-TMS-EE2两种衍生物，但在相同条件下添加吡啶试剂仅生成di-TMS-EE2。

(2) 使用BSTFA(1% TMCS)+吡啶试剂作为衍生化试剂，衍生化产物单一且稳定，分离效果好，灵敏度高。

(3) 本研究提出一种新型的衍生化加热方式即干燥烘箱70 ℃加热40 min，操作方
便，衍生化效果相对水浴和微波加热得到很大提升，具有良好的应用前景。

(4) 本研究优化的衍生化方法准确度高，精密度好，为环境中这5种雌激素类物质的分析提供了参考。

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