温针灸对兔膝关节退变模型血清MMP-1和MMP-13水平的影响

温针灸对兔膝关节退变模型血清MMP-1和MMP-13水平
的影响
刘娣;武永利;张艳玲;许建峰;马晓秀;路宗志
【摘要】目的观察温针灸治疗兔膝关节退变模型前后血清基质金属蛋白酶1、13(MMP-1,MMP-13)及软骨形态的变化,探讨温针灸治疗膝骨性关节炎的作用机理.方法 30只雄性兔随机分为模型组、温针灸组和西药组,每组10只,采用右后肢伸直位固定制作兔膝关节退变模型.采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测造模前、治疗前和治疗后兔血清中MMP-1,MMP-13水平,参考彭太平法观察膝关节组织形态学变化.结果治疗2周后,大体和光镜观察模型组膝关节软骨变薄,出现明显的关节软骨损伤,温针灸组可明显改善关节软骨组织学结构.各组治疗前较造模前血清MMP-1、MMP-13的浓度均显著升高(P＜0.05);治疗两周后,与模型组比较,温针灸组MMP-1、MMP-13水平降低(P＜0.05),但与西药组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论温针灸能治疗KOA的软骨损伤,可能与降低MMP-1和MMP-13表达有关.
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2014(036)005
【总页数】4页(P497-499,504)
【关键词】膝骨性关节炎;温针灸;MMP-1;MMP-13
【作者】刘娣;武永利;张艳玲;许建峰;马晓秀;路宗志
【作者单位】宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院中医骨伤科,银川750004;宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院中医骨伤科,银川750004;宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院中医骨伤科,银川750004
【正文语种】中文
【中图分类】R245
膝骨性关节炎(knee osteoarthritia，KOA)，又称为增生性、肥大性或退行性骨关节炎。

由于骨性关节炎是一种缓慢的病理发展过程，临床上多为中老年人患病，故又称为老年性骨关节炎。

基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和基质金属蛋白酶-
13(MMP-13)在骨质退变过程中起着重要的作用。

温针灸具有温阳补虚、行气活血的作用，在治疗膝关节退变方面已取得良好的疗效[1]。

作者前期研究已经了解到KOA的发生发展与一些炎性因子增多有关[2-3]。

本实验通过建立动物膝关节退变模型，研究用温针灸治疗兔膝关节退变的效应，及对血清MMP-1和MMP-13的影响，为温针灸治疗膝关节退变提供理论和实验依据。

1 实验材料
1.1 实验动物健康雄性新西兰兔30只，体重(
2.37±0.25)kg，购自西安交通大学实验动物中心。

1.2 实验药品及试剂无菌针灸针(环球牌,苏州医疗用品有限公司,规格：
0.25mm×25mm，执行批准号：GB2024-1994)。

清艾条(无锡市药条厂，规格：18mm×200mm，国药准字：Z32021163)。

双氯芬酸钠(北京诺华制药公司，规格75mg，批号04089)。

兔MMP-1、兔MMP-13的ELISA试剂盒(武汉华美生物技术有限公司，CUSABIO公司生产，产品编号：CSB-E009744Rb)。

2 实验方法
2.1 动物分组新西兰大耳兔购回后适应性喂养3d，随机分为3组：模型组(M)、
西药组(X)、温针灸组(W)，每组10只，称重标记。

2.2 选穴温针灸组参照《实验针灸学》[4]和《实验动物针灸手册》[5]选用足三里、内膝眼、外膝眼及鹤顶四穴进行治疗。

2.3 造模方法 3组均采用右后肢膝关节伸直位石膏固定[6]。

方法:将兔毛剪短至
0.3cm 左右,由助手将其右后肢膝关节完全伸直,用管型石膏将之固定于过伸位,长度从髋关节远端约2cm至踝关节上缘2cm，待石膏干硬后,再放回兔笼。

从造模当
天起计算时间并密切观察,一旦发现有肢端明显肿胀、张力性水泡或溃烂感染及石
膏松脱、咬损严重等现象，则立即重新造模。

2周后随机从各组中抽出1只以空气栓塞法处死，取关节软骨做病理检查，确定造模成功后去除石膏外固定。

2.4 治疗方法于造模两周后拆除石膏固定，对膝关节进行大体观察。

模型组不予
任何处理，正常饲养；西药组给予双氯芬酸钠0.35mg灌胃，每天1次，治疗2周；温针灸组取上述穴位，经常规消毒后用一次性针灸针直刺0.3cm左右，将清
艾条切割成1cm左右长，套置在针柄上，从艾绒下端点燃，直至艾绒燃尽弃针。

避免烫伤。

每天1次，共治疗2周。

2.5 血清MMP-1和MMP-13检测所有兔子均在造模前，治疗前及治疗后从耳缘静脉采用静脉血,低温离心(3000r·min-1)后,吸取血清分别放入2个Eppendorf试管中- 70℃液氮冰箱中保存，以备统一检测。

采用B10 - RAD酶标仪、680型洗
板机按照说明书进行操作和检测。

2.6 大体观察处死动物后参考彭太平[7]法大体观察关节面。

将病损分为3级：Ⅰ级：关节面光滑,有光泽,软骨透明,无明显缺损和新生物;Ⅱ级：关节表面不光滑,色
泽暗,软骨透明度低，有细小缺损和少许新生物；Ⅲ级：关节表面不光滑,无光泽,软骨不透明,可见明显缺损和新生物(骨赘)。

2.7 关节的组织学观察采血后，取各组右膝关节，常规制作石蜡组织切片，HE染
色后镜下观察关节软骨。

2.8 统计学处理采用SPSS 11.0软件，大体观察比较采用秩和检验，其他数据均
采用均数±标准差表示，两两比较采用LSD检验。

检验水准为a=0.05。

3 结果
3.1 治疗2周后3组动物关节面的大体观察温针灸治疗组关节损伤较模型组及西
药治疗组轻，见表1。

表1 治疗2周后3组动物关节面大体观察结果组别n 病损分级/只 I级Ⅱ级Ⅲ
级温针灸组▲★ 10 8 2 0 西药组 10 3 3 4 模型组 10 0 2 8
与西药组比较▲P<0.05；与模型组比较★P<0.05
3.2 治疗2周后3组动物关节面的光镜观察 HE染色光镜下观察关节软骨退变：模
型组关节软骨表面欠光滑、不完整，裂隙多，裂隙周围细胞明显减少，可见软骨层
变薄，基质染色变浅，细胞核浓缩；西药组关节软骨表面基本完整、光滑，软骨细
胞数目未见明显的改变；温针灸组关节软骨表面基本完整、光滑，软骨细胞数目明
显增多，且软骨细胞排列整齐、饱满，着色均匀，基质丰富。

见表1，图1(封3)。

3.3 3组膝关节退变模型兔血清MMP-1、MMP-13浓度的变化各组治疗前与造
模前比较，MMP-1和MMP-13浓度显著升高(P<0.05)，差异有统计学意义；治
疗2周后温针灸组血清MMP-1和MMP-13浓度较模型组和西药组均显著降低，
差异有统计学意义(P<0.05)；西药组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

见表2、表3。

表2 各组膝关节退变模型兔血清MMP-1浓度变化组别n造模前治疗前
治疗后模型组100.92±0.211.49±0.29※1.55±0.12西药组
100.89±0.221.46±0.23※1.46±0.27温针灸组
100.93±0.151.45±0.25※0.91±0.05*▲
与造模前比较※P<0.05；与模型组比较＊P< 0.05；与西药组比较▲P< 0.05
表3 各组膝关节退变模型兔血清MMP-13浓度变化组别n造模前治疗前
治疗后模型组100.85±0.311.31±0.22※1.22±0.24西药组
100.84±0.271.28±0.24※1.12±0.09温针灸组
100.86±0.211.30±0.22※0.87±0.05*▲
与造模前比较※P<0.05；与模型组比较＊P< 0.05；与西药组比较▲P< 0.05
4 讨论
膝骨性关节炎属中医“痹症”范畴，《素问·长刺节论篇》曰“病在骨，骨不可举，骨髓酸痛，名日骨痹”；《素问·痹论》曰“风寒湿三气杂至，合而为痹”，“痛着，寒气多也，有寒故痛也”都提到寒气是痹症主要的致病因素之一。

本研究根据中医治疗原则“寒者热之”而采用具有温经通络、行气活血作用的温针灸疗法。

《灵枢·官刺》“输刺者，直入直出，深内之至骨，以取骨痹，此肾之应也”；《医学入门》：“凡药之不及，针之不及，必灸之”。

温针灸具有针刺和艾灸的双重作用，在针刺活血通络，调整气血的同时，配合灸的热敏刺激，改善局部微循环，具有温阳补虚、行气活血的作用，临床研究已表明温针灸治疗膝骨关节炎的近、远期疗效肯定[8-9]，本文则对温针灸治疗KOA的疗效进行了实验验证。

本研究选用足三里、犊鼻、内膝眼和鹤顶穴。

《通玄指要赋》说“冷痹肾败，取足阳明之上。

”以取其健脾补气，祛风通络之要；犊鼻穴屈膝，在膝部，髌骨与髌韧带外侧凹陷中取穴，内膝眼屈膝，在膝部，髌骨与髌韧带内侧凹陷中取穴，两穴均为临近部位取穴，腧穴所在，主治所及，其具有通经活络，理气止痛，为治疗KOA基础穴；鹤顶为下肢奇穴，是治疗膝关节痛经验穴，四穴合用补虚通络，固
本驱邪外出，以治疗KOA。

KOA是以软骨退变为中心的，其病理改变的程度直接反映了软骨的退变情况。

引
起膝关节退变的机制主要有：①物理因素的影响；②激素代谢异常；③软骨细胞的过度凋亡[10]；④基质金属蛋白合成及基质破坏[11]；⑤ 生物活性蛋白分子如IL-1、IL-6 、IL-17、IL-18等致炎因子的产生而使膝关节的内环境产生恶性循环。

参照尚平等[6]采用右后肢伸直位固定可使软骨细胞的凋亡指数显著升高，并随着固
定时间延长，凋亡指数将持续升高。

右后肢伸直位固定法与其他外科手术造模方法相比，既节省了经费，也降低了兔子死亡的风险，且操作简单。

MMP-1，又称胶原酶-1，主要由成纤维细胞分泌，可切割I、II、III、VIII、X型
胶原及明胶。

MMP-1的活性增强对于软骨基质的降解起着关键性的作用，有研究证明MMP-1在骨关节炎表达明显增高，在发病过程中持续起作用，而且MMP-1的增高表达与软骨退变的程度正相关[12]。

MMP-13也称为胶原酶-13，其降解Ⅱ型胶原纤维的能力是其他胶原酶的10～30 倍，而且其他许多MMPs 亚型对Ⅱ型
胶原的降解需要通过MMP 13起作用。

MMP-13 是已知最有效的Ⅱ型胶原降解
酶[13]。

本实验结果显示膝骨关节炎模型组MMP-1和MMP-13血清浓度明显升高，增高的MMP-1和MMP-13促进了软骨组织中Ⅱ型胶原的降解，使关节软骨的完整性遭到破坏。

与模型组比较，KOA兔经温针灸与西药治疗后，血清MMP-1和MMP-13的浓度均有降低，同时经治疗后三组动物关节面大体观察示温针灸治疗
组关节损伤小于模型组及西药治疗组，光镜下温针灸组的软骨膜平整，细胞排列整齐，软骨细胞也相对增多，这不仅说明温针灸和扶他林可降低KOA兔血清中MMP-1、MMP-13的水平，同时也进一步证明了软骨的客观变化与MMP-1、MMP-13的浓度变化成正相关，温针灸组降低的程度高于西药组,从而延缓了软骨的退变过程。

目前临床上常用的西药多属非甾体类抗炎药(扶他林也属于其中一种)，不能直达病所，需要持续的血药浓度才能取得较好的效果，但用药时间过长又会引起相应的副作用。

而温针灸具有治疗范围广、见效快、安全稳定、方便节约、易学
易用等优点，较易令人接受，且作用能够直达病所。

通过前期研究我们也已经了解到KOA的发生发展与白介素-1、白介素-6 、白介素-17、白介素-18、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2等因子有关[14-15]，究竟这些因子之间有什么必然的联系还有待于进一步研究。

综上所述，温针灸能治疗KOA的软骨损伤，并降低血清中MMP-1、MMP-13的含量，说明温针灸治疗KOA的机理与其抑制MMP-1和MMP-13的表达有关，为温针灸防治膝关节退变提供了实验依据。

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