酶工程 简答整理

酶与一般催化剂的共同点是：
只能催化热力学所允许的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点；
在化学反应的前后，酶本身没有质和量的改变；
很少的量就能发挥较大的催化作用；
其作用机理都在于降低了反应的活化能。

而酶作为生物催化剂，与一般催化剂相比又具有以下明显的特性：………p15 1．极高的催化效率。

一般而言，酶促反应速度比非催化反应高108～1020倍，比其他催化反应高107～1013倍。

2.高度的专一性。

酶对其所催化的底物和反应类型具有严格的选择性，一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，催化一定类型的化学反应，并生成一定的产物，这种现象称为酶的专一性或特异性。

3．酶活性的可调节性。

酶是细胞的组成成分，和体内其他物质一样，在不断地进行新陈代谢，酶的催化活性也受多方面的调控。

4．酶的不稳定性，要求温和的反应条件
酶的本质是蛋白质，酶促反应要求一定的pH、温度等温和的条件。

因此强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、高温、紫外线等任何使蛋白质变性的理化因素都可使酶的活性降低或丧失。

酶的可调节性包括哪几个方面………………………………………………p17 9（2+7）point~~
酶的高效性有哪些机制？…………………………………………………p22-25
1.酶能降低反应的活化能，使得反应在较低的能量水平上进行，加速反应。

2.形成中间产物…………………………p22
3.酶作用高效率的机理
酶如何发挥高效性？（l）邻近效应和定向效应（2）分子形变与诱导契合（3）酸碱催化（4）共价催化（5）金属离子的催化（6）活性中心的低介电性（7）协同催化（多元催化）
酶分子的空间结构
酶分子的空间结构即是维持酶活性中心所必需的构象。

酶分子的肽链以β折叠结构为主，折叠结构间以α螺旋及折叠肽链段相连。

β折叠为酶分子提供了坚固的结构基础，以保持酶分子呈球状或椭圆状。

在三级结构构建过程中，β折叠总是沿主肽链方向于右手扭曲，构成圆筒形或马鞍形的结构骨架。

α螺旋围绕着β折叠骨架结构的周围或两侧，形成紧密曲折折叠的球状三级结构。

由于非极性氨基酸（如苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丙氨酸Ala等）在β折叠中出现的几率很大，因此在分子内部形成疏水核心；表面多为α螺旋酸性氨基酸(Asp、Glu)残基的亲水侧链所占据。

除少数单体酶外，大多数酶是由多个亚基组成的寡聚体，亚基间的空间排布，即是酶的四级结构。

亚基之间缔合状态的不同决定了酶的活性高低。

亚基间主要依靠疏水作用缔合，范德华力、盐键、氢键等也具有一定作用。

蛋白质分子中的非共价键有哪些(次级键)？
1. 氢键氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。

氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。

氢键的键能较低(~12kJ/mol)，因而易被破坏。

2. 疏水键非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。

蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。

3. 离子键（盐键）离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。

在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。

4．范德华氏（van der Waals)引力原子之间存在的相互作用力。

化学修饰的方法
磷酸化-去磷酸化乙酰化-脱乙酰甲基化-脱甲基腺甘化-脱腺甘 SH- -S-S-互变
影响酶催化作用的因素
决定酶催化活性的因素有两大方面：
一是酶分子的结构（包括一级结构、空间结构和活性中心结构）；
二是反应条件，如底物浓度、抑制剂、激活剂、温度、pH等。

研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学叫酶促反应动力学………………………………………p27 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。

在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。

温度对酶促反应速度的影响………………………………………………………………p34
温度对于酶的作用有两种不同的影响。

①和一般化学反应相同，酶反应在一定的温度范围（0～40℃）内，其速度随温度升高而加快。

根据一般经验，温度每升高10℃，反应速度约增加1倍。

②化学本质为蛋白质的酶和核酶，遇热易变性失去活性，绝大多数酶在60℃以上即失去活性。

温度对反应速度的影响是以上两种相反作用综合的结果。

pH对酶活的影响……………………………………………………………………………p35 （1）pH的改变可以破坏酶的空间构象，引起酶蛋白变性失活；（2）pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使底物转变成产物的过程受到影响；（3）pH的改变影响酶活性中心结合基团的解离，从而使底物不能与其结合；（4）pH的改变影响底物的解离状态，使酶和底物不能结合，或者结合后不能生成产物；（5）pH的改变影响中间复合物的解离状态。

双底物双产物的反应………………………………ppt第一章
有序反应机理：A和B两个底物结合在酶分子的不同位点上。

当酶和A底物结合后，改变了酶分子构象，使原来隐藏酶分子内部的B底物结合部位暴露出来，B底物才与酶结合。

随机反应机理：A和B两个底物结合在酶分子的不同位点上。

当酶和A底物结合后，改变了酶分子构象，使原来隐藏酶分子内部的B底物结合部位暴露出来，B底物才与酶结合。

乒乓机制底物A先与E结合成AE二元复合物，AE → PE’（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与E’形成E’B，E’B →EQ，释放第二个产物Q。

在所有底物与酶结合之前，就有产物的释放，底物与酶的结合和产物的释放一来一去，好像打乒乓球一样。

故称为乒乓机制。

★整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式。

酶活力(enzyme activity)是指酶催化一定化学反应的能力。

……………p42 酶活力高低用酶活力单位（U）来表示。

国际酶学委员会曾规定：在特定条件（25℃、具有最适底物浓度、最适温度、最适pH和离子强度系统）下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1国际单位（IU）。

酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），表明酶的最大催化效率。

转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。

Eg：乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。

比活力是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质表示。

一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。

酶活力的测定方法
酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。

酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。

（一）终止反应法终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。

产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。

（二）连续反应法连续反应法无需终止反应而是在酶反应过程中用光学仪器来监测反应进行情况。

其中以光谱吸收的变化更为准确。

酶活力测定中应注意的几个问题
首先,测定的酶反应速度必须是初速度,只有初速度才与底物浓度成正比。

初速度的确定一般指:底物消耗量在5%以内,或产物形成量占总产物量的15%以下时的速度。

其次,底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和),否则,底物浓度本身是一个限制因子,此时的反应速度是两个因素的复变函数。

第三,反应必须在酶的最适条件(如最适温度、pH和离子强度等)下进行。

此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。

用反应速度（v）对酶浓度（[E]）作图，应得一条通过原点的直线，即v为[E]的线性函数。

酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比
调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基
因结合
阻遏效应举例
酶的诱导有活性
－＋
不转录，
继而不翻译
诱导物
－
转录，
继而翻译
乳糖操纵子
酶的阻遏无活性
－
阻遏物＋不转录，
继而不翻色氨酸操纵子
微生物发酵产酶
优良产酶菌种应具备的条件（1）酶产量高（2）易培养（生长速率高、营养要求低）（3）遗传性能稳定，不易退化（4）易分离提纯（5）安全可靠（不是致病菌）
产酶微生物的分离和筛选
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品； 2)富集培养: 投其所好，取其所抗；
3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）； 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主；
5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

产酶微生物优良菌种的选育诱变育种；原生质体融合育种；基因工程育种；微生物发酵产酶方法
1.固体培养:特别适合于霉菌培养
2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式
3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器
微生物酶的类型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。

2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。

植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感
主要产物色素、药物、香精、
酶等
醇、有机酸、氨基酸、
抗生素、核苷酸、酶等
疫苗、激素、单克隆
抗体、酶等
植物细胞培养产酶应用最广的是MS培养基和LS培养基
培养方法：悬浮细胞培养①细胞株的建立；外植体与愈伤组织；②扩大培养；
③大罐培养；
外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。

愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。

培养条件的影响与控制（1）温度（2）pH （3）通气与搅拌（4）光照的控制
（5）前体的添加（饲喂）（6）诱导子（elicitors）的应用
动物细胞培养产酶
1.动物细胞培养的特点①细胞生长速度慢。

（需添加抗生素）②细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。

③反应过程成本高，产品价格贵。

④细胞具有锚地依赖性。

⑤原代细胞一般繁殖50代。

2.培养基①天然培养基②合成培养基③无血清培养基
3.培养方法 (1)悬浮培养 (2)贴壁培养
(3)贴壁－悬浮培养微载体培养；包埋和微囊培养；结团培养
4.培养条件的影响与控制（1）温度：一般控制在36.5℃. （2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。

（3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。

（4）溶解氧：根据情况随时调节。

酶的纯度检验
当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为酶已纯化，仍需电泳、层析、离心等方法对纯化的酶进行纯度检验。

（注意标明使用何种方法检验的.不同方法检验的纯度可能不一致。

如电泳纯、层析纯、HPLC纯。

）
方法特点
超速离心检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系
电泳必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一起移动SDS－电泳可测出分子量，多亚基时会出现多条区带
等电聚焦检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象
N－末端分析只适用于一条肽链
免疫技术高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。

(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各种柱层析法。

(3) 均质纯化(homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或 HPLC。

酶的物理化学性质建立的一般方法：
1）溶解度：盐析；有机溶剂沉淀法；选择性沉淀法；共沉淀法；PEG沉淀；等电点沉淀；2）分子大小差异：凝胶过滤；超过滤；离心；超离心；
3) 电学、解离特性差异：吸附；离子交换；电泳（区带、等电聚焦）；聚焦层析；疏水层析；
高压层析(HPLC)；
4) 稳定性差异：选择性热变性；选择性酸碱变性；选择性表面变性；
5）特殊基团差异: 亲和层析；
沉淀分离分离原理………………………………………… p147-153
盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。

等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使
酶与杂质分离。

有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。

复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。

选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的
酶，从而使酶与杂质分离。

萃取分离…………………………………………………………… p153-157
过滤借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

（过滤介质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜）
截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质
粗滤> 2μm 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、
固形物等
滤纸、滤布、纤维多孔陶
瓷、烧结金属等
微滤0.2～2μm 细菌、灰尘等
微滤膜、微孔陶瓷
超滤20Å～0.2μm 病毒、生物大分子等
超滤膜
反渗透< 20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜
膜分离：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状的物质颗粒或分子进行分离的技术。

使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。

①加压膜分离；②电场膜分离；③扩散膜分离
结晶是溶质以晶体的形式从溶液中解析出的过程…………………………p214 结晶意义: 可以提高纯度,获得较高纯度的酶 ;同时有些物理性质的研究需要结晶的酶。

如X射线晶体衍射测结构。

结晶条件：通常要求酶的纯度足够，且不同的酶对纯度的要求不一样；酶的浓度合适，太低不产生结晶、太高晶体小不易长大。

还要控制好温度、pH、离子强度等。

常用的结晶方法：改变溶解度
①盐析结晶法：加盐降低溶解度；②有机溶剂结晶法：加有机溶剂，含盐少，时间短，但要注意防止变性；③透析平衡结晶法；④等电点结晶法: 调节pH达到PI,注意防止局部过酸或碱常配合透析平衡、扩散法；⑤温度差法结晶；⑥金属离子复合结晶法；
浓缩……………………………………………………p212
从低浓度酶液中去除部分水或其它有机溶剂而成为高浓度溶液的过程。

为防止酶变性失活要求低温或快速，常用的有真空蒸发器(低温）和薄膜蒸发器(快速）
干燥 :获得含水少的固体
干燥后的固体提高了产品的稳定性，易于保存、运输和使用。

真空干燥
冷冻干燥:成本高适合热敏物质。

喷雾干燥:接触时间短、快速
气流干燥:设备简单、操作方便，易失活
吸附干燥:使用干燥剂。