高效液相色谱外标法快速测定茶碱血药浓度

.硏究.
Drug Research China Pharmaceuticals2018年7月20日第27卷第14期
Vol. 27, No. 14, July 20, 2018
•实验研究• doi: 10. 3969/j. issn. 1006 -4931. 2018. 14. 002高效液相色谱外标法快速测定茶碱血药浓度
刘光斌，姜芳宁，高颖，何苗苗
(酒钢医院，甘肃嘉峪关735100)
摘要：目的建立快速测定人血清中茶碱质量浓度的高效液相色谱（HPLC)外标法。

方法血清样品经甲醇与5%高氯酸沉淀蛋白后，以
甲醇-水（20 : 80, F: 为流动相，流速为1.0 m L/m in,色谱柱为Inertsil ODS -S P柱（150 mmx4. 6 mm，5 p m),柱温为30 ，紫外检
测波长为270 nm;用建立的外标法与文献报道的内标法就测定结果进行比较。

结果血清内源性杂质不干扰待测物测定，茶碱质量浓度
线性范围为1.2〜3/6 p g/m L,日内、日间精密度的兄SZ)均小于10%，样品稳定性良好；两种方法测定的结果都接近理论值，无显著性
差异（P> 0.05)。

结论该方法灵敏、快速、准确，操作简便，可以替代内标法用于茶碱的血药浓度监测。

关键词：茶碱；高效液相色谱法；外标法;血药浓度
中图分类号：R927.2;R974.3 文献标识码：A 文章编号：1006-4931牗018)14-0004-03 Rapid Determination of Serum Concentration of Theophylline by HPLC -External
Standard Method
Liu G u a n g b i,Jiang F a n g i, (Hospital of Jiuquan Iron & S t e l〈Group >, , , , Abstract：Objective To establish a rapid HPLC -external standard method for determination of theophylline in human serum. Methods Serum samples were treated by methanol and 5% perchloric acid. The mobile phase was methanol - water (20 • 80 ,
V：V),the flow rate was 1.0 mL/min , chromato/raphic column was Inertsil ODS - SP column(150 mm x4. 6 mm , 5 pm), the column temperature was 30 C, the detection wavelength was 270 nm. The results determined by the established internal standard method and
the internal standard method reported in literatures were compared. Results The intrinsic impurity of plasma did not interfere with the determination of analytes. The linear range of theophylline was 1.2-3/6pg/m L, the RSDs of intraday and intraday precision were
less than 10%. The stability of samples was good. The determination results of two methods were close to the theoretical value , and
there was no significant difference ( P>0. 05). Conclusion The method is sensitive , rapid , accurate and easy to operate , whi place the internal standard method to monitor the serum concentration of theophylline.
Key words ： theophylline; HPLC; external standard method; serum concentration
茶碱(theophylline)为甲基嘌呤类衍生物，主要用于 治疗慢性哮喘。

茶碱血药浓度个体差异大，有效范围为 5 ~20 pg/mL，安全范围窄，治疗指数低，故有必要在其 使用过程中监测血药浓度[1]。

测定茶碱血药浓度的方法 有高效液相色谱(HPLC)法、紫外法(UV)、气相色谱法 (GC)、免疫测定法、高效毛细管电泳法（HPCE)等[1]。

H PLC法检测成本低，专属性、灵敏度、分离度均良好, 但文献报道大多采用内标法测定,且样品前处理过程需 要萃取、复溶等复杂操作，技术性较强。

本研究中采用直 接沉淀蛋白法处理样品，并与内标法测定结果进行比 较,结果显示外标法快速、简单，符合临床检测要求。

现 报道如下。

1仪器与试药
1.1 仪器
LC-2010A H T型高效液相色谱系统，包括自动进 样器、在线真空脱气机、四元高压泵及温控系统（日本岛津公司）；LC Solution工作站、AUW120D型十万 分之一电子分析天平（日本岛津公司）。

1.2试药
茶碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 100121 - 199903);甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Inertsil ODS- SP 柱（150 mm X4.6 mm, 5 pm);柱温：30 C ;流动相：甲醇-水（20 : 80, V:V);流速：1.0 mL/min;检测波长:270 nm;进样量：20 p L。

2.2 溶液配制
茶碱标准溶液：称取茶碱对照品，精密称定，置 50m L容量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，配制 成质量浓度为39.6 pg/m L的茶碱贮备溶液，冰箱(4 C)存放，临用前用甲醇稀释成不同质量浓度。

茶碱标准血清样品及质控样品：取数支1.5 m L的离心管，精密加入不同质量浓度的茶碱标准溶液各0.lm L,分别加入空白血清0.5 mL,配制成相应质量浓度的茶 碱标准血清样品及质控样品。

第一作者：刘光斌，男，大学本科，主任药师，研究方向为医院药学，（电话）0937 - 6714796(电子信箱）j/yylgb@sina. com。

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v〇i. 27, n〇. 14, July2〇, 2018 China Pharmaceuticals
.研究. Drug Research
2.3 样品处理
精密量取血样0. 5 mL,置1.5 m L离心管中，添加 甲醇0. 1mL,再加5%高氯酸0.5mL,涡旋混合10 min,以12 000r/m in的速率离心10min,取上清液，用0.22|xm 微孔滤膜滤过，以40 ^L为进样量，进样分析。

茶碱血清样品。

每个样品测定5次，以平均值作为测定 值，用测定值和实际值计算回收率。

3种质量浓度的溶 液同一日内测定5次计算日内精密度，连续5日内每日 测定1次计算日间精密度。

结果见表1。

表1 回收率和精密度试验结果
2.4 方法学考察血中质量浓度实测质量浓度相对回收平均相对回精密度尺SD(%)
专属性试验:在拟订色谱条件下，茶碱的吸收峰约 在7.7 m in出现，峰形尖锐，基线平稳，杂峰不干扰测定 (分离度大于1.5)。

色谱图见图1。

U/rnN (pg/mL)(|Jig/mL)率(％)收率(％)日内日间5.0 4.692.00 4.22 6.87 19.819.497.9895.82 2.034．32 39.638.697.47 2.543．21
200.
10
0 -—
0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
A
t/m in
200 10 0U/mS
X-
5．010．0
/m in
U/mV
0 2. 5 5. 0 7. 5 10. 0 12. 5
1.茶滅
A.标准溶液
B.标准溶液+空白血清
C.患者血清样品
D.空白血清
图1 高效液相色谱图
线性关系考察:取数支1.5 m L离心管，分别精密加
人 1.2,2. 5,5. 0,9. 9,19. 8,39. 6 |xg/mL系列质量浓度 的茶碱标准溶液，以茶碱血清药物质量浓度（C)对应峰 面积（/0进行线性回归，得回归方程C= 2.416 85 x 10-M+0. 378 36,= 0.999 9牗=6)。

结果表明，血清 中茶碱质量浓度在1.2~39. 6 |x//m L范围内与峰面 积线性关系良好。

茶碱的有效血药浓度为5 ~ 20 |x//mL，
稳定性试验:参照文献犤]，取数支1.5 m L离心管，精密加人质量浓度分别为5.0,19. 8,39. 6 |x//m L的茶 碱质控样品0.25 mL，平行制备5份。

第1份按血清 样品处理方法处理后即刻（时刻A)进样;第2份室温条 件放置4h，按血清样品处理方法处理后（时刻B)进样; 第3份在4°C放置24 h，按血清样品处理方法处理后 (时刻C)进样;第4份置冰箱内冷冻4周后取出，融化，按 血清样品处理方法处理后(时刻D)进样;第5份在4周 内冻、融3次，再按血清样品处理方法处理后（时刻E)进样。

结果见表2。

表2 血清中茶碱稳定性试验结果
质量浓度(|Jig/mL)RSD(%C )加入时A B C D E
5. 00 4.404．21 3.904．52 4.69
6.99 19. 8019．8118. 5318.4018.7718.58 3.03 39. 6036．6635．5438.243
7.2337. 55 2.74
2. 5 内标和外标法测定结果比较
分别取5.0,19. 8,39. 6 |xg/m L质量浓度的茶碱血 清样品溶液，用本研究方法和文献方法（内标法）[3]分别 测定，结果见表3。

经f检验，两种方法测得的回收率 比较，差异无显著性（P> 0.05)。

取服用茶碱的患者 血样20份，分别用本研究方法和文献方法（内标法）[3]测定，结果经/金验，两种方法测得值比较，差异无显著 性（尸>0.05)。

表3 内标法与外标法测定结果比较
理论质量浓度实测质量浓度(|JLg/mL)回收率(％)
(|Jig/mL)内标法外标法内标法外标法
5.00 4. 70 4.6094．0092．00
19.8019.2019.4096．9797．98 39.6037.9038.6095.7197．47
此范围可以满足临床检测需要。

茶碱的最低检测限为 3 讨论
0.4 |xg/m L(信噪比以S/A^3 : 1计)。

模拟临床常用联合用药，将哮喘患者及COPD患者
回收率和精密度试验：取1.5 m L离心管数支，分常用的各种药物与茶碱进行混合测定，结果发现诸多常 别取茶碱标准溶液适量，置离心管中，添加空白血清用药物均不干扰茶碱血药浓度的测定，说明本方法特异 0.5 mL,配制成5.0,19. 8,39. 6 |xg/m L3种质量浓度的 性较高。

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Drug Research China Pharmaceuticals2018年7月20日第27卷第14期
Vol. 27, No. 14, July 20, 2018•检验检测• doi： 10. 3969z/j. issn. 1006 -4931. 2018. 14. 003
高效液相色谱法测定胃痛舒片中厚朴酗与和厚朴酗含量
张火旺，黄潇潇，邓淑芳
(广东省河源市药品检验所，广东河源517000)
摘要：目的建立测定胃痛舒片中厚朴酚与和厚朴酚含量的高效液相色谱（HPLC)法。

方法采用InertSustain Ci8柱(250 mmx 4. 6 mm,
5 pm),流动相为甲醇-水牗8 : 22)，检测波长为294nm,流速为1. 0mL/min。

结果厚朴酚及和厚朴酚进样量分别在0. 032 19〜0. 4024盹和
0.035 00〜0.437 6畔范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率分别为98.94%和98. 58% ,兄SZ)分别为0. 89%和0.74%牗=6)。

结论该方法简便、重复性好、准确，可作为胃痛舒片质量的控制方法。

关键词：胃痛舒片；厚朴酚;和厚朴酚；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号:R927.2;R975 +.l文献标识码：A 文章编号：1006-4931牗018) 14 -0006 -03 Content Determination of Magnolol and Honokiol in Weitongsliu Tablets by HPLC
Zhang Huowang，Huang Xiaoxiao，Deng Shufang
(Hejuan Institute for Drug C o n t r l,H e j u a n,G u a n g d o, Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of magnolol and honokiol in Weitongshu Tablets. Methods The InertSustain Cis column(250 mm x 4. 6 mm , 5 (xm) was adopted. The mobile phase was methanol - water (78 : 22) , the
第一作者：张火旺（1974 -)男，副主任药师，研究方向为药品检验及质量标准，（电话）0762 - 3220381(电子信箱）zhwl011@ 163. com。

据报道，茶碱血药浓度检测使用的波长有273, 254,210 nm等,其中以270 nm左右居多犤-5。

对不同波 长分别进行比较，发现波长为270 n m时其他组分对茶 碱的干扰较小,色谱响应较强，灵敏度高。

用5%高氯酸、乙腈和甲醇分别作为血清蛋白沉淀 剂进行试验,结果单纯使用5%高氯酸沉淀时色谱图中 段有馒头样峰出现，且基线不稳定;选用乙腈、甲醇时回 收率达不到要求;最终采用5%高氯酸和甲醇联合作为 沉淀剂时回收率达标、基线稳定。

5%高氯酸的用量参照 文献使用标本量的80% [6]。

血药浓度测定因前处理步骤烦琐，需用内标法校 正,但也有文献提出内标法需要加入其他物质作为内 标，增加操作步骤而增加了操作误差，因此内标法未必 能明显改善血药浓度检测方法的精密度[7]。

本研究中建 立的外标法与文献报道的内标法犤]的测定结果均接近 理论值，且无显著性差异（P> 0.05),说明两种测定方 法可互相替代。

本研究中使用外标法进行过诸多药物血 药浓度的研究，结果均较满意犤-10]。

有文献报道，H PLC法测定茶碱血药浓度时选择 的流动相有0.03 m〇l/m L磷酸盐-乙腈-水犤犦、甲醇- 0.05 m〇l/m L硫酸锂[11]、甲醇-水-0. 1%三氟乙 酸[12]等。

本研究中采用甲醇和水为流动相，不需使用 其他盐和酸，故成本较低、操作简单，为较理想的检 测方法。

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(收稿日期：017-12-28)
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