门冬酰胺酶的制备与分析

门冬酰胺酶的制备与分析
重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定
赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏⽩华⼭
1 原理
本实验主要是利⽤基因⼯程⼿段构建L-天冬酰胺酶基因⼯程菌。

L-天冬酰胺酶的⽣理作⽤主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对⾮霍奇⾦淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作⽤，⽬前适⽤于治疗⿊⾊素瘤、⾮何杰⾦病淋巴瘤等，也可以⽤于治疗急性单核细胞性⽩⾎病、慢性淋巴细胞性⽩⾎病等。

⽬前，我国虽已投⼊⽣产L-天冬酰胺酶，但是较国外⽣产成本⾼、菌种产酶活性低，提取纯化⼯艺落后。

针对这些问题，本实验对⼤肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进⾏了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化⼯艺，分析其鉴定⽅法与性质。

本实验主要进⾏了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋⽩的诱导表达条件分析；酶蛋⽩分离纯化⼿段的⽐较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离⼦交换层析以及亲和层析；重组蛋⽩酶活⼒监控与本底蛋⽩活⼒测定等等。

2 实验材料
实验仪器见表1.1。

型号和⽣产⼚家根据实验室现有条件核定。

表1.1 实验仪器或装置
仪器名称型号⽣产⼚家
超净⼯作台
PCR扩增仪
恒温培养箱
超低温冰箱
台式离⼼机
恒温摇床
涡轮振荡器
⾼压灭菌锅
蛋⽩电泳仪
核酸电泳仪
凝胶成像仪
紫外分光光度计
⾼效液相⾊谱仪
扫描型紫外分光光度
计
制冰机
超声清洗机
实验试剂和材料见表1.2。

材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。

表1.2 试剂和材料
试剂或材料材质或规格来源
E.coli 野⽣型菌株CPU21009 实验室储存
pMD18-T 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司
pET-22b 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司
Nde Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司
Xho Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司T4 DNA Ligase 350U/µl 宝⽣物⼯程有限公司
DNA纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司
胶回收试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司
CaCl
2
60mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存
NaCl 分析纯
Taq 酶 Mix 分析纯
(NH
4)
2
S
2
O
8
分析纯
C 2H
6
OS 分析纯
CH
4
O 分析纯冰⼄酸分析纯
C 2H
6
O 分析纯
氨基丁三醇分析纯
考马斯亮蓝分析纯
SDS 分析纯
Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯
L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋⽩胨分析纯
⽢氨酸分析纯
琼脂糖分析纯
葡萄糖⾷品级
TEMED 优级纯
溴酚蓝分析纯
IPTG 优级纯
丙三醇分析纯
3 实验思路与步骤
本实验设计从⼤肠杆菌野⽣型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增⽬的基因ansB，随后对PCR产物进⾏纯化。

后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导⼊宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。

后将构建的⼯程菌在合适的培养条件下发酵培养，利⽤IPTG诱导表达重组蛋⽩，对重组蛋⽩进⾏提取纯化。

再由考马斯亮蓝法测定蛋⽩浓度，SDS-PAGE电泳测定分⼦量以及进⾏肽图分析和紫外扫描并与天然产品⽐较。

同时，实验过程中以纳⽒试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活⼒，并计算回收率。

3.1⼤肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取
3.1.1 ⼤肠杆菌ansB基因的选择与引物
从NCBI中查找获取⼤肠杆菌ansB的基因序列，其Gene ID为947454，基因长度为1047bp,序列如下：
1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca
61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac
121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg
181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc
241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat
301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc
361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc
421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat
481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt
541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct
601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc
661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat
721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc
781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg
841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc
901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac
961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag
1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa
根据该基因序列，使⽤Primer 5.0 设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下：上游引物P1 ：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA
下游引物P2 ：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG
上游引物P1 中包含⼀个Nde Ⅰ酶切位点，下游引物中包含⼀个Xho Ⅰ酶切位点。

所设计引物交由南京华⼤基因科技有限公司负责合成。

3.1.2 ⼤肠杆菌全基因组DNA的提取
使⽤⼤肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：
(1)从实验室斜⾯保存的E.coli野⽣型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50 mL的液体LB培养基，在温度37℃、180 r／min发酵过夜。

(2)取菌液1 mL⾄1.5 mL的离⼼管管中，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，离
⼼3 min，弃去上清液。

(3)加⼊0.2 mL GA缓冲液，⽤漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮。

加⼊ 4 µL RNaseA(100mg／mL)溶液，⽤涡旋振荡器振荡振荡15 s，室温放置5 min。

(4)加⼊0.02 mL蛋⽩酶K，混合均匀。

(5)加⼊0.02 mL GB缓冲液，混合均匀，将⽔浴锅调到70℃，把离⼼管放⼊10 min，短暂离⼼除去离⼼管管盖和管壁的⽔珠。

(6)加⼊0．22 mL分析纯⼄醇，在15 s内充分混匀，此时会出现絮状物，短暂离⼼除去EP管盖和管壁的⽔珠。

(7)将(6)中所得絮状物和液体均加⼊安装进收集管的吸附柱中，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，弃去柱底液体，安装好吸附柱。

(8)加0.5 mL GD缓冲液⾄吸附柱中，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(9)加0.6 mL PW漂洗液⾄吸附柱中，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(10)再加0.5 mL GD缓冲液，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min倒掉柱底液体。

(11)将吸附柱放⼊收集管中，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，倒掉柱底液体。

在室温下静置20 min吸附柱，完全晾⼲漂洗液，使吸附材料⼲燥。

(12)将⽆⼄醇⽓味的吸附柱放⼊⼲净的离⼼管中，悬滴0.04 mL双蒸⽔到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，收集溶液。

(13)将(12)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min。

(14)将提取后的DNA进⾏琼脂糖凝胶电泳鉴定，以便⽤于后续操作。

3.1.3PCR扩增ansB基因
(1)在PCR扩增仪上设计如下反应程序：
①模板DNA预变性94℃ 5 min；
②变性：94 ℃条件下45 s；
③退⽕：58 ℃条件下30 s；
④延伸：72 ℃条件下1 min；
⑤循环步骤②～④30次；
⑥最后在72 ℃延伸10 min。

(2)在PCR管建⽴整体为0.05 mL的PCR扩增反应体系：
⼤肠杆菌总DNA模板0.003 mL
上游引物P1 0.001 mL
下游引物P2 0.001 mL
Taq酶Mix 0.025 mL
ddH2O 0.02 mL
(3)将样品混合后稍作离⼼，将反应管放⼊PCR扩增仪中进⾏PCR反应。

(4)结束PCR扩增，取0.005 mL溶液，进⾏1％Agarose gel electrophoresis鉴定，判断是否有基因⽚段存在于PCR中，以及其⼤⼩。

3.1.4 PCR扩增产物的纯化
(1)将0.04 mL PCR扩增后体系⽤双蒸⽔调整⾄0.1 mL，加⼊0.5 mL结合液DB，充分混匀。

(2)将(1)中得到的溶液加⼊安装好的吸附柱，在室温下静置1 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，倒掉管底的液体。

(3)加⼊0.5 mL⽤于洗涤的溶液，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，倒掉管底的液体。

(4)加⼊0.5 mL⽤于洗涤的溶液，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，倒掉管底的液体。

(5)将吸附柱重新安装好，空管离⼼2 min，尽最⼤可能得除去⽤于漂洗的液体，防⽌⽤于漂洗的液体中残留的分析纯⼄醇在下游反应中有影响。

(6)取吸附柱，悬滴0.04 mL双蒸⽔到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，收集溶液。

(7)将离⼼管中的双蒸⽔，重新加⼊吸附柱中，室温放置2 min后，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min。

(8)将PCR纯化产物进⾏1％Agarose gel electrophoresis鉴定，以⽤于后续操作。

3.2 重组克隆载体的构建
为了⼤量准确扩增⽬的基因⽚段，采⽤构建克隆载体的⽅法。

由于PCR扩增时采⽤的DNA聚合酶为Taq酶，故扩增序列带有⼀段“A”，采⽤TA克隆连接载体。

载体选择T载体，且要求载体在宿主细胞内为⾼拷贝，能够稳定⾃主表达。

这⾥选⽤pMD 18-T载体。

构建好的克隆载体导⼊宿主中后，要进⾏阳性克隆筛选与鉴定，并⽤双酶切回收。

3.2.1 ⽬的基因与载体的连接
pMD18-T Vector是⼀种⾼效克隆PCR产物（TA Cloning）的专⽤载体。

本
载体由pUC18载体改建⽽成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插⼊了EcoR V识别位点，⽤EcoR V 进⾏酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”⽽成。

因⼤部分耐热性DNA聚合酶进⾏PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加⼀个“A”的特性，所以可以⼤⼤提⾼PCR产物的连接、克隆效率。

载体酶切图谱如图1.1。

本载体以pUC18载体为基础构建⽽成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。

此外，⾼效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接⽤于细菌转化，⼤⼤⽅便了实验操作。

实验操作如下：
(1)在⼀个标准的10µL连接反应体系中加⼊：
pMD18-T载体1µL
PCR纯化产物1.5µL
ddH2O 2.5µL
Solution I 5µL
(2)16 ℃连接2 h。

图 1.1 克隆载体pMD 18-T的酶切图谱
3.2.2 ⼤肠杆菌Top 10感受态细胞的制备
⼤肠杆菌TOP10菌株来源于MC1061菌株，是⽬前实验室最常⽤的基因⼯程宿主细胞之⼀，基因型与DH10B⾼度类似
（DH10B为galE15型，⽽TOP10为galU型），具有链霉素抗性。

其适⽤于⾼效的DNA克隆和质粒扩增，能保证⾼拷贝质粒的稳定遗传。

(1)从实验室保存的⼤肠杆菌Topl0菌株斜⾯上，⽤接种环挑取单个菌落，转移⾄液体的50 mL LB培养基中，37 ℃下180 r/min 摇床过夜发酵。

(2)取0.01 mL菌液转移到液体的50 mL LB培养基中，37 ℃下150 r/min振荡约
3.5 h左右，⾄菌液对数期。

(3)将液体培养基全部移⼊50 mL离⼼管中并配平，4 ℃下离⼼机参数调⾄3000离⼼10 min，弃去上清液。

(4)添加15 mL预冷的氯化钙溶液轻轻吹打。

4℃下离⼼机参数调⾄3000离⼼10 min，弃去上清液。

(5)添加1.5 mL预先冰浴的氯化钙(60 mmol/L CaCl2、质量分数为15％的⽢油、pH 7.2)溶液，⽤枪轻轻吹⾄完全悬浮，分装⾄⼲净的EP管，每管0.2 mL，放在80℃超低温冰箱。

3.2.3 重组克隆质粒的转化
(1)含有Ampicillin l00 mg/mL的LB培养基的制备。

(2)取⼀管200µL的⼤肠杆菌Top l0感受态细胞，在冰上化冻，加⼊重组质粒的连接产物10µL，轻轻⽤枪吹打混匀。

(3)另做⼀个宿主菌阴性对照，即200µL的感受态细胞，加10µL⽆菌⽔，混匀。

(4)冰浴30 min。

(5)迅速放⼊在42℃下热击90 s，再迅速放回冰中冰浴3 min。

(6)加⼊到1 mL的液体LB培养基混合，37℃ 150 r/min培养1 h，细胞恢复正常⽣长，并表达Ampicillin抗性基因。

(7)将上述菌液摇匀后，分别取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL在含有Ampicillin的LB 培养基板上均匀涂布。

(8)将上述平板37℃倒置培养过夜(不超过24 h)，观察菌斑的出现效果。

3.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定
(1)从Ampicillin LB培养基板上挑取单个的菌落，液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜，取5 mL过夜菌液加⼊离⼼管中，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，弃去上清废液。

(2)使⽤离⼼柱型质粒提取试剂盒。

向菌体沉淀管中加⼊0.5 mL Pl溶液(含溶菌酶、核糖核菅酸酶)，⽤移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离⼼管中加⼊0.6 mL P2溶液，翻转6-8次，充分裂解菌体。

在这⼀点上。

菌液变得澄清、黏黏的，时间不超过5 min，以免损坏质粒。

如果不澄清，可能是由于过量加菌液，未能彻底裂解，应减少细菌⽣长量。

(4)向离⼼管中加⼊0.6 mL P3溶液，马上轻轻地翻转6-8次，混合彻底，会有⽩⾊絮状物出现。

离⼼机参数调⾄12000离⼼10 min后，离⼼管底有固体出现。

加⼊P3，⽴即翻转，避免局部沉淀。

若上清液有微⼩⽩⾊固体，再离⼼取上清。

(5)将上清液加进平衡过的吸附柱中，吸附柱安装好，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，⼩⼼地将离⼼管中的溶液分次加⼊原有吸附柱，安装好吸附柱。

(6)加⼊0.6 mL PW漂洗液，将台式离⼼机参数设置为12000，离⼼1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(7)加⼊0.6 mL PW漂洗液，将台式离⼼机参数设置为12000，离⼼1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(8)将台式离⼼机参数设置为12000，将组件离⼼2 min，除去吸附柱中的残留的⽤于漂洗的液体。

吸附柱在室温下静置5 min，防⽌⽤于漂洗的液体中残留的分析纯⼄醇在下游反应中有影响。

(9)将⽆⼄醇⽓味的吸附柱放⼊⼲净的离⼼管中，悬滴0.04 mL双蒸⽔到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，收集溶液。

(10)将(9)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min。

(11)取5 µL质粒溶液⽤于琼脂糖凝胶电泳。

(12)克隆载体中含有Nde I和Xho I两种限制性酶酶切位点，构建10µL双酶切反应体系：
Nde I 0.5µL
Xho I 0.5µL
10 × H buffer 1µL
pMDl8-T-ansB质粒8µL
37℃酶切2 h后，取5µL进⾏1％琼脂糖凝胶电泳。

3.3 重组表达质粒的构建
3.3.1 重组克隆载体质粒的提取
(1)从相应的培养基上挑取含有重组克隆载体pMDl8-T-ansB质粒
的菌种的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基，⽤180 r/min的参数，在37 ℃下培养12 h以上。

在离⼼管中加5 mL 收获的菌液，离⼼机参数调⾄12000离⼼l min，留下沉淀。

pMDl8-T-ansB质粒提取过程同1.3.2.4的(2)-(11)。

(2)5µL质粒溶液⽤于琼脂糖凝胶电泳，其余-20℃保存。

3.3.2 重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应
(1)Nde I、Xho I双酶切重组克隆载体pMDl 8-T-ansB质粒反应体系：
pMDl8-T-ansB质粒40µL
10×H buffer 5µL
Xho I 2.5µL
Nde I 2.5µL
总体积50µL
(2)pET-22b Plasmid酶切反应体系：
pET-22b Plasmid 40 µL
10× H buffer 5 µL
Xho I 2.5µL
Nde I 2.5µL
总体积50 µL
(3)分别将两个体系置于37℃⽔浴中酶切2 h后，取5µL此进⾏1％琼脂糖凝胶电泳。

3.3.3 酶切⽚段的胶回收
(1)经琼脂糖凝胶电泳确认酶切结果后，剩下的45µL酶切反应产物中均匀加⼊5 µL l0×上样缓冲液，再全加到⼤孔胶的上样泳道中。

(2)在100 V电压下电泳⾄条带跑⾄总胶长的2/3处。

将胶块放⼊EB浓度为0.5µg/mL的溶液中染⾊，⼤⼩为1000 bp(ansB)、5000 bp(pET-22b)左右。

(3)在紫外灯照射下，判定DNA位置，⽤⼲净的⼑⼦分别切下的含有要回收DNA 的胶块。

(4)取1.5 mL EP管，放到分析天平上称重后，加⼊切下的胶块再称重，计算胶块的质量。

(5)每100 mg胶块加⼊0.6 mL DB溶胶液，按(4)中称取的重量加⼊相应体积的DB，在55℃下反应10 min，使胶块彻底溶于液体。

安装好组件，离⼼机参数调⾄10000离⼼1 min，收集沉淀。

(6)安装好吸附柱，加0.5 mL⽤于漂洗的液体，离⼼机参数调⾄10000离⼼1 min。

重复漂洗，去除废液。

离⼼2 min，弃去废液。

(7)在室温下静置吸附柱，开启盖，待⼄醇⽓味完全消失后放⼊⼲净的EP管，悬滴0.04 mL双蒸⽔到吸附膜的中间部分。

在室温静置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2min，收集溶液。

(8)将(7)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，EP管中的即为胶回收产物。

(9)胶回收产物5µL进⾏1％Agarose gel electrophoresis。

3.3.4 构建表达载体pET-22b-ansB
下图所⽰为表达载体pET-22b的酶切图谱。

图 1.2 表达载体pET-22b的酶切图谱
pET-22b是⼀种⼤肠杆菌表达载体，载体⼤⼩在5500bp左右。

其含有多克隆位点，其中就含有我们⽬的基因引物⽚段构建中引⼊的Ned Ⅰ和Xho Ⅰ两种限制性酶切位点。

它含有氨苄青霉素抗性标记，且含有PelB信号肽序列，能够将表达的⽬的蛋⽩定位在细胞外周质腔。

(1)取⼀⽀1.5mL的⼲净EP管，按如下加样后混匀：
胶回收双酶切pET-22b质粒产物18µL
胶回收双酶切ansB⽚段 6 µL
T4 DNALigase 3 µL
10×Ligase buffer 3 µL
总体积30 µL
(2)⽤离⼼机甩⼀下，使溶液集中于底部。

(3)16℃恒温连接3 h后，4℃暂时保存，⽤于转化BL21感受态细胞。

3.3.5 ⼤肠杆菌BL21感受态细胞的制备
从实验室保存的⼤肠杆菌Topl0菌株斜⾯上，⽤接种环挑取单个菌落，转移⾄50 mL液体LB培养基，37℃，180 r/min隔夜发酵。

感受态细胞的制备步骤同1．3．2．2的(2)-(5)。

3.3.6 表达载体pET-22b-ansB的转化
(1)含有Ampicillin l00 mg/mL的LB培养基板的制备。

(2)取⼀管200µL的⼤肠杆菌BL21感受态细胞，在冰上化冻，加⼊T4 DNA连接产物10µL，轻轻⽤枪吹打混匀。

(3)另做⼀个宿主菌阴性对照，即200此的感受态细胞，加10 µL⽆菌⽔，混匀。

(4)冰浴30 min。

(5)迅速放⼊在42℃下热击90 s，再迅速放回冰中冰浴3 min。

(6)加⼊到1 mL的液体LB培养基混合，37℃ 150 r/min培养1 h，细胞恢复正常⽣长，并表达Ampicillin抗性基因。

(7)将上述菌液摇匀后，分别取0.1mL在含有Ampicillin l00µg/mL的LB培养基板上均匀涂布。

(8)将上述平板37℃倒置培养过夜(不超过24 h)，观察菌斑的出现效果。

3.3.7 阳性表达载体pET-22b-ansB的筛选与鉴定
(1)从Ampicillin LB培养基板上挑取单个的菌落，液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜，取5 mL过夜菌液加⼊离⼼管中，离⼼机参数调⾄12000离⼼1 min，
弃去上清废液。

(2)向菌体沉淀管中加⼊0.5mL Pl溶液(含溶菌酶、核糖核苷酸酶)，⽤移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离⼼管中加⼊0.6 mLP2溶液，翻转6-8次，充分裂解菌体。

在这⼀点上。

菌液变得澄清、黏黏的，时间不超过5 min，以免损坏质粒。

如果不澄清，可能是由于过量加菌液，未能彻底裂解，应减少细菌⽣长量。

(4)向离⼼管中加⼊0.6 mL P3溶液，马上轻轻地翻转6-8次，混合彻底，这时会有⽩⾊絮状物出现。

离⼼机参数调⾄12000离⼼10 min后，离⼼管底会有固体出现。

加⼊P3，⽴即翻转，避免局部沉淀。

如果上清液有微⼩⽩⾊固体，再离⼼，取上清。

(5)将上⼀步获得的上清液加进平衡过的吸附柱中，吸附柱安装好，离⼼机参数调⾄12000离⼼2 min，⼩⼼地将离⼼管中的溶液分次加⼊原有吸附柱，安装好吸附柱。

(6)加⼊0.6mLPW漂洗液，将台式离⼼机设置为12000，离⼼1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(7)加⼊0.6 mLPW漂洗液，将台式离⼼机设置为12000，离⼼1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(8)将台式离⼼机设置为12000，将组件离⼼2 min，除去吸附柱中的残留的⽤于漂洗的液体。

吸附柱在室温下静置5 min，防⽌⽤于漂洗的液体中残留的分析纯⼄醇在下游反应中有影响。

(9)将⽆⼄醇⽓味的吸附柱放⼊⼲净的离⼼管中，悬滴0.04 mL双蒸⽔到吸附膜的
中间部分，在室温静置5 min，离⼼管参数调⾄12000离⼼2 min，收集溶液。

(10)将(9)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离⼼管参数调⾄12000离⼼2 min。

(11)取5µL质粒溶液⽤于琼脂糖凝胶电泳。

(12)构建10µL双酶切反应体系：
Nde Ⅰ0.5µL
Xho Ⅰ0.5µL
10 ×H buffer 1 µL
pET-22b-ansB质粒8 µL
(13)双酶切成功，委托华⼤基因测序。

3.4 AnsB蛋⽩的诱导表达与纯化
3.4.1 IPTG诱导重组蛋⽩AnsB的表达
IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插⼊序列所能够翻译的蛋⽩，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。

IPTG ⼴泛⽤于诱导表达系统，但是IPTG 有⼀定毒性，有⼈认为在制备医疗⽬的的重组蛋⽩并不合适，因⽽也有⽤乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。

(1)在⽆菌环境下，⽤接种针挑取重组⼯程菌(pET-22b-ansB)单菌落，转⼊50 mL 液体LB培养基(终浓度为100µg/mL Ampicillin)中，在37℃恒温摇床中150 r/min 培养12 h以上。

从上述细菌菌液中接种0.1mL到新鲜的50 mL终浓度为100µg/mL Ampicillin的LB液态培养基中，在37℃摇床中250 r/min恒温振荡约4 h⾄⽣长指数期，测定菌液在600 nm波长下吸光度值为0.8⾄1.0之间。

(2)取 5 mL的上述重组⼯程菌(pET-22b-ansB)发酵液保存，以便进⾏后续SDS-PAGE凝胶电泳对照实验。

(3)向剩余发酵液中加⼊异丙基硫代半乳糖苷使浓度⾄0.6mmol/L，3℃下250 r/min引诱重组AnsB蛋⽩表达5 h。

3.4.2 蔗糖溶液提取L-天冬酰胺酶
⼤肠杆菌能产⽣两种天冬酰胺酶。

⽆抗癌活性的天冬酞胺酶Ⅰ存在于细胞质中，有抗癌活性的天冬酞胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。

以往对L-天冬酰胺酶的提取纯化常采⽤丙酮破碎细胞，有机溶剂反复分级沉淀的⽅法,酶活⼒损失较⼤。

据中国药科⼤学刘景晶等研究报道，⽤蔗糖溶液抽提细胞，主要是提取位于细胞周质中的酶。

提取结束时，多数细胞并未发⽣破裂，因此提取液粘稠度不⼤，可以⽤8000r/min离⼼除去细胞。

并且该法的提取收率⾼于超声波破壁法、冷丙酮⼲燥破壁法及反复冻融法。

向菌体细胞中加⼊5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40% ,溶菌酶200mg/L , EDTA 10 mmol/L , pH 7.5)，在30℃振荡2⼩时,
8000r/min离⼼30分钟，收集上清酶液。

3.4.3 硫酸铵分级沉淀和透析
为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采⽤较为温和的硫酸铵分级沉淀。

具体⽅法为⽤蔗糖溶液提取法获得的酶液，加⼊硫酸铵⾄55%饱和度，调pH⾄7.0，室温搅拌1⼩时，离⼼除去沉淀。

上清液中加⼊硫酸按到90%饱和度，离⼼收集沉淀。

实验验证破壁液中酶浓度⾼于378 IU/ml时,酶易与杂质-起沉淀,回收率下降,但过低时,虽然回收率增⾼,但杂质的去除率必定会下降,故应选择378 IU/ml左右进⾏沉淀。

在pH为4.9时,盐析的沉淀效果最好,回收率达89.1%。

沉淀物⽤。