醉椒素脂质体的制备及其理化性质考察

醉椒素脂质体的制备及其理化性质考察
陈玉堂;袁曼;朴军颜;闫淑娟;徐霞
【摘要】Kavain lipsomes were prepared and the chemicophysical propery was studied. Kavain lipsomes were prepared by dispersion film-ultrasonication method and the content of kavain was determined by HPLC. The character and partical size of kavain lipsomes were observed. The lipsomes were regular under its microphotograph and the size range was (161 ±5)nm. The surface charge of lipsomes was (2.37 ± 0.2) mV. The encapsulation efficiency of kavain in lipsomes was 77. 09%. No obvious changes were found in the above indexes. The kavain liposome prepared
by dispersion film-ultrasonication method was of high encapsulation efficiency and of good stability.%制备醉椒素脂质体并对其稳定性进行考察.采
用薄膜-超声分散法制备脂质体,利用高效液相色谱法测定其主药含量,并考察其粒径、Zeta电位、包封率等指标及在室温与4℃保存14 d的稳定性.所得脂质体粒径小
而均匀,粒径均值为(161±5)nm,Zeta电位为(2.37 ±0.2) mV,包封率均在77.09％
以上,稳定性考察各项指标均无明显改变.由此可以得出结论,所制制剂包封率较高,稳定性良好.
【期刊名称】《郑州大学学报（理学版）》
【年(卷),期】2013(045)001
【总页数】4页(P73-76)
【关键词】醉椒素;脂质体;理化性质;包封率
【作者】陈玉堂;袁曼;朴军颜;闫淑娟;徐霞
【作者单位】郑州大学药学院河南郑州450001
【正文语种】中文
【中图分类】R944.1;R979.1
0 引言
醉椒素(kavain)是从卡瓦胡椒根中提取的活性成分，卡瓦胡椒是胡椒科多年生直立灌木类药用植物，产于南太平洋诸岛，野生或栽培，根和根茎入药，鲜叶亦可药用.该植物一直是这些岛国居民的生活用品，用作放松机体和情绪、恢复体力和减轻疼痛，近年来开始为欧美人所接受，并成为目前美国和德国最畅销的草药之一.1769年James Cook发现卡瓦胡椒根中含有Kavain methysticin，yangonin等内酯
成分［1］.现代药理研究表明醉椒素具有镇静催眠、抗痉挛和局部麻醉的作用［2］.并且对前列腺癌细胞PC-3具有较好的杀伤作用［3］，但其生物半衰期较短，口服生物利用度低，大剂量长时间服用卡瓦制品可能导致肝细胞损伤、黄疽、肝硬化甚至肝功能衰竭等.故开发脂质体制剂具有深远意义.
脂质体属于靶向给药系统的一种新剂型.它可以将药物或者溶液包埋在直径为纳米
级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，从而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性［4］.本实验采用薄膜分散法制备了醉椒素脂质体，并考察了其体外释放，为后期体内的研究奠定基础.
1 仪器与材料
Nano-ZS型激光散射粒径分析仪(英国Malvern公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);SHB-Ⅲ循环水室多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);BP211D型电子天平(德国赛多利斯有限公司);μV-2102C型紫外分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司);Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent紫外检测器(美国安捷伦公司).
天然大豆磷脂(LIPOID S-100，SPC)(上海东尚实业有限公司);S188泊洛沙姆(南京威尔化工有限公司);醉椒素(上海时代生物科技有限公司，纯度＞95%);甲醇为色谱纯;胆固醇、氯仿均为分析纯.
2 方法与结果
2.1 醉椒素脂质体的制备
采用薄膜超声法.称取处方量的大豆卵磷脂、胆固醇和醉椒素溶于12 mL氯仿中，水浴超声溶解，得脂质溶液.37℃恒温水浴减压旋转蒸发出有机溶剂，使磷脂等成膜材料在茄形瓶壁上形成均一类脂膜.称取泊洛沙姆188少量溶于5 mL葡萄糖溶液中，即为水相;将水相加入茄形瓶后水合90 min，进行冰浴探超，300 W探超3 s，间歇6 s，30次，即得醉椒素脂质体.
2.2 粒径和粒度分布、表面电位研究
取适量醉椒素脂质体溶液，稀释50倍，注入到Nano-ZS纳米粒度和Zeta电位分析仪的石英检测池，分别测定粒径和Zeta电位.结果显示粒径呈单峰分布，范围在100～200 nm，均值为(161±5)nm，表面电位为(2.37±0.2)mV.
2.3 醉椒素脂质体包封率的测定
2.3.1 标准储备溶液的配置取醉椒素对照品约5.0 mg，精密测定，置于50 mL 容量瓶中，用甲醇-水(70∶30)溶解并稀释至刻度，摇匀，100 μg/mL作为标准储备液.
2.3.2 脂质体破乳方法分别取空白脂质体、醉椒素脂质体各0.5 mL，分别加甲醇4.5 mL，在旋涡混合器上充分振荡混匀5 min，取1.0 mL置于1.5 mL离心管中，6 000 r/min离心5 min，取上清液20 μL进样分析.
2.3.3 色谱条件色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇 -水(70∶30)，柱温25℃，检测波长为246 nm.体积流量为1
mL/min，进样量为20 μL.
2.3.4 专属性实验取“2.3.1”项下醉椒素标准贮备液及“2.3.2”项下空白脂质体破膜溶液、空白脂质体破膜溶液+醉椒素贮备液各50 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱.在该色谱条件下，空白脂质体不影响醉椒素的测定且峰形稳定，保留时间
为5.45 min，脂质体辅料和破膜溶液不干扰醉椒素的测定，详见图1.
图1 高效液相色谱Fig．1 HPLC
2.3.5 标准曲线的制备精密量取醉椒素标准储备液适量，分别用甲醇稀释制成浓
度为100.0，80.0，60.0，40.0，20.0，10.0，5.0，1.0 μg/mL 的醉椒素对照品
溶液，于上述色谱条件下测定，进样20 μL，以醉椒素峰面积与浓度作线性回归，得回归方程 y=137．26x-58．805(R=0.999 7)，结果表明醉椒素1.0～100.0
μg/mL线性关系良好.
2.3.6 回收率实验用空白脂质体和醉椒素标准储备液，配置浓度分别为1.00
μg/mL，20.00 μg/mL，60.00 μg/mL的样品各3份，按“2.3.2”项下破膜方法处理，进行分析，以测得浓度除以理论配置浓度计算回收率.高、中、低浓度的回
收率均符合样品分析的要求.回收率实验结果详见表1.
表1 醉椒素回收率试验结果(n=3)Tab．1 Recovery of docetaxel(n=3)_加入量/(μg·mL-1) (Mean±SD)/% RSD/% 平均回收率/%1.00 78.34±2.13 2.17 20.00 80.37±2.64 2.63 79.97±2.47 _60.00 81.20±2.49 2.46
2.3.7 精密度试验取“2.3.6”项下高、中、低3个浓度的溶液，各5份，以1 d
内每个浓度连续测定5次醉椒素的浓度，计算日内精密度;以连续3 d测得醉椒素浓度计算日间精密度.精密度实验结果详见表2.
2.3.8 醉椒素脂质体包封率的测定按照”2.1”项下的方法制备脂质体样品3份，精密吸取上述醉椒素脂质体1.0 mL，加超纯水稀释至5.0 mL量瓶中，将上述脂质体混悬液置于超速冷冻离心机中，12 000 rpm，4℃离心30 min，离心2次分离脂质体和游离药物，取1 mL上清溶液，HPLC法测定醉椒素的浓度(C游).
表2 醉椒素精密度实验结果Tab．2 Inter-day and intra-day precision of kavainConcentration____/(μg·mL-1)Inter-day_(Mean±SD)/% __RSD/% Intra-day(Mean±SD)/% __RSD/%1.00 1.12±0.04 5.39 0.95±0.06 8.55 20.00 19.38±0.13 2.61 20.49±0.31 4.12 _60.00 59.64±0.077 3.92 59.21±0.52 4.28
精密吸取醉椒素脂质体1.0 mL，用甲醇稀释至适量倍数，HPLC法测定醉椒素的浓度(C总).
C总为脂质体中混悬液中药物的总质量浓度，C游为脂质体游离药物的质量浓度.结果，所制备脂质体样品的平均包封率为(77.09±2.47)%，该法重现性较好.
2.3.9 稳定性考察将醉椒素脂质体按5 mL分装在西林瓶中，于25℃和4℃冰箱中分别放置保存.分别于0 d，7 d，14 d观察其外观性状并检查平均粒径、Zeta 电位及包封率3个参数，每次取3小瓶检测以考察脂质体的稳定性.结果，所制备制剂于25℃，14 d内，均为淡蓝色乳光的均匀混悬液.样品稳定性考察结果详见表3.
表3 样品稳定性考察结果(n=3)Tab．3 Stability of samples(n=3)25℃4℃指标
0 d 7 d 14 d平均粒径/mm 156±0.2 168±1.2 169±1.2 156±0.2 170±1.3
1 0 d 7 d 14 d 72±0.9 Zeta电位/mV 2.24±0.7 2.34±0.
2 2.54±1.6
2.24±0.7 2.38±0.5 2.45±1.1___包封率/% __70.43±1.5 68.75±1.1 65.41±0.9 70.43±1.5 65.91±0.9 6
3.47±2.5____
3 讨论
薄膜分散超声法制备脂质体的常用方法，该法制备的醉椒素脂质体能增加脂质体膜的稳定性和均一性，使醉椒素更好的包裹在脂质体中.
薄膜分散超声法制备的脂质体为多层脂质体［5］，如果不经过探超处理，脂质体粒径一般比较大，并且波动也比较大.脂质体粒径的大小决定其靶向的位置，并且也影响其在体内的稳定性，大的脂质体易被网状内皮系统吞噬，在体内的半衰期较短，而肝、脾可以减少对小于200 nm的脂质体的摄取.试验中采用探超法，得到粒径大多在135～200 nm内，且分布均匀.
本实验采用超高速离心法测定包封率，由于分子密度不同，含药脂质体和游离醉椒素在转速达到12 000 rpm时作用30 min，就会分为上下两层.该方法简单易行，便于操作.
在考察脂质体的初期稳定性，主要以外观状态、平均粒径、Zeta电位以及包封率作为参考指标，25℃和4℃密封放置14 d，以上指标无显著性改变，现有处方、工艺条件所制备的脂质体制剂有良好的稳定性.
参考文献:
［1］杨卫东，张金萍，王敬文.卡瓦胡椒引种栽培及药用价值［J］.浙江农业科学，2005，5(5):343-345.
［2］王厄舟，潘胜利，张淑芳.卡瓦胡椒活性成分及药理活性研究进展［J］.中草药，2001，32(9):855-858.
［3］ Li Xuesen，Liu Zhongbo，Xu Xia，et al.Kava components down-regulate expression of AR and AR splice variants and reduce growth in patient-derived prostate cancer Xenografts in mice［J］.PLoS One，2012，
7(2):312-313.
［4］钱思源.申报细胞毒类抗肿瘤药物脂质体的立题考虑和临床研究方法［J］.中国临床药理学杂志，2006，22(6):472-474.
［5］高申.现代药物新剂型新技术［M］.北京:人民军医出版社，2003.。