荧光染料基础知识大全

荧光染料基础知识大全
纺织染整团队今天
荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果,比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。

在组织样本中,目的基因无法进行克隆,则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。

为此,就需要利用抗体,这些抗体连接各种不同的荧光染料,直接或间接地与相应的靶结构相结合。

此外,借助荧光染料,荧光显微镜技术不只局限于蛋白质,它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色,即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。

1免疫荧光<IF>
在荧光显微镜技术中,可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用源荧光信号,即通过克隆手段,用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。

有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。

比如,组织学样品无法使用荧光蛋白,因为通常来说,标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。

此外,当有一个有功能的抗体可用时,免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多,因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。

荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。

因此,细胞的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性,其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。

然而,荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。

免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性,对此它还有两种不同的表现形式。

最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。

这种方法被称为"直接免疫荧光法"。

在很多情况下,我们可以利用两种不同特性的抗体。

第一种抗体可以结合目的蛋白,但其本身并未进行荧光标记〔一抗。

第二种抗体本身就携带荧光染料〔二抗,并且可以特异性结合一抗。

这种方法被称为"间接免疫荧光法"。

这种方法存在诸多优势。

一方面,它会产生放大效应,因为不只一个二抗可以与一抗相结合。

另一方面,没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体,但可以使用市售荧光标记的二抗。

免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor®染料,下文均有提及。

2FITC 和TRITC
异硫氰酸荧光素<FITC> 是一种有机荧光染料,目前,这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。

在495/517 nm 处,该染料会产生激发/发射峰值,并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合,该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。

而它的基本成分——荧光素,其摩尔质量为332 g/mol,常被用作荧光示踪剂。

FITC<389 g/mol> 是用于荧光显微镜技术的首批染料,且其被当成Alexa Fluor®488 等后续荧光染料的发端。

该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统,而该系统受蓝色光谱中的光所激发。

经常与FITC 同时使用的另一种染料是与其相似的TRITC [四甲基罗丹明-5<6>-异硫氰酸]。

与FITC 相反,TRITC 并非荧光素,而是罗丹明家族的衍生物。

罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统,正是该系统引发了它们的荧光行为。

还有一点与FITC 相反,TRITC <479 g/mol> 由最大波长为550nm的绿色光谱中的光所激发,它的最大发射波长为573 nm。

与蛋白质〔例如,抗体结合也基于异硫氰酸盐反应基团。

虽然FITC 和TRITC 仍在使用,但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠,因此,在最新的显微镜技术中并不推荐。

图1：果蝇胚胎发育,绿色：FITC；红色：TRITC
3青色素
这类荧光染料相对较少,从青色素衍生而来,也是其名称的由来：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。

上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸或蛋白相连。

例如,采用了蛋白标记的马来酰亚胺基团。

有趣的是,对于荧光,Cy5 对其周边电子环境非常敏感,该特征可用于酶测定。

附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。

此外,Cy3 和Cy5 还可用于FRET 试验。

青色素染料是一种相对较老的荧光染料,但却是其他荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善的基础。

4Alexa Fluor®染料
Alexa Fluor®染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列,该系列染料囊括围较广,且经常用于荧光显微镜技术之中。

这些染料的名称是由其发明者Richard Paul Haugland 以他儿子Alex Haugland 的名字命名的。

该产品标识是Molecular Probes〔美国生命科学技术公司Life Technologies旗下子公司,注：20XX2月Life Technologies被Thermo Fisher收购的商标。

此外,这些产品标识中也涵盖了相应的激光激发波长。

例如,应用围很广且最大激发波长为493 nm的Alexa Fluor®488,可由标准的488 nm激光激发。

Alexa Fluor®488的最大发射波长为519 nm,正是因为具备上述特性,使得Alexa Fluor®488与FITC 的属性相似。

尽管Alexa Fluor®488是一种荧光素衍生物,但与FITC 相反,它拥有更佳的稳定性和荧光亮度,且pH 敏感度也更低。

所有Alexa Fluor® 染料〔比如,Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633都是不同基础荧光物质的磺化形式,例如,荧光素、香豆素、青色素或罗丹明,它们的摩尔质量在410 至1400 g/mol 围之。

图2：小鼠转基因胚胎、肢间体节,E10.5 小鼠转基因胚胎的 5 个肢间体节：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫组化染色；用Desmin-Cy3 对胚胎肌肉纤维进行染色,用Hoechst Size 自上而下揭示细胞核：3.5 mm <a>,800 µm <b>。

图片来源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of I GBMC, IGBMC。

图3：小鼠成纤维细胞,绿色：F-Actin,FITC；红色：Tubulin,Cy5；蓝色：细胞核,DAPI。

图片来源：德国·海德尔堡·马克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士
5DNA 染色
在荧光显微镜技术中,不只研究蛋白结构,核酸同样具有重要的研究意义。

有时候,必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位置及其数量。

最常用的一种DNA 染色剂当属DAPI <4',6-二脒基-2-苯基吲哚> ,其可与DNA 双螺旋的A-T 富集区域相结合。

如果DAPI 附着到DNA 上,其荧光强度将比游离状态要高。

该染色剂受最大波长为358 nm的紫外光激发,其发射光谱非常宽,在461 nm 处达到峰值。

此外,还可对弱荧光进行RNA 结合检测。

在这种情况下,发射波长将转移至500 nm。

有趣的是,DAPI 能够穿透整个细胞膜。

因此,它可以用于固定和活细胞之中。

第二种被广泛使用的DNA 染色剂就是Hoechst 染料系列,这些染料原先都是由Hoechst AG 这家化学公司生产的。

Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均为双苯酰亚胺,可嵌入A-T 富集区域,因此,该系列染料很少用到。

与DAPI 相似,这三种染色剂都可受最大发射波长为455 nm的紫外光激发,而未被结合的染色剂,其最大发射波长在510–540 nm 之间。

Hoechst 染色剂还具有细胞渗透性,因此可用于活细胞或已固定的细胞中。

该染色剂与DAPI 的不同之处在于,它们的毒性较低。

碘化丙啶〔Propidium-Iodide,PI是一种不能透过细胞膜的DNA 染色剂。

由于具备上述特性,该染色剂无法进入完整的细胞中,因此,该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。

此外,碘化丙啶还是一种嵌入剂,但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。

该染色剂与核酸结合后,最大激发波长为538 nm,最大发射波长为617 nm。

未结合PI 的最大激发和发射波长和光强会更低一些。

PI 还可结合RNA,同时无需改变自身的荧光特性。

有时候为了区分DNA 和RNA,有必要使用适当的核酸酶。

不需要前期处理,吖啶橙就可以鉴别DNA 与RNA 。

吖啶橙与DNA 结合后,最大激发/发射波长为502 nm/525 nm,而与RNA 结合后,最大激发/发射波长为460 nm/650 nm。

此外,它还能够进入溶酶体等酸性区室。

在这里,阳离子染料被质子化。

在这种酸
性环境下,吖啶橙由蓝色光谱中的光激发,但发射波长在橙色区域达到最大。

由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室,因此,吖啶橙常用作此类细胞的标记物。

6区室和细胞器特异性染料
在荧光显微镜技术中,往往要对溶酶体、核体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。

为此,该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。

观察线粒体最常用的方法就是利用MitoTracker®,它是一种可透过细胞的染料,包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。

正因如此,它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应,从而与基质蛋白实现共价结合。

MitoTracker® 有不同的颜色和修饰类型〔参见表1,此外,它还是Molecular Probes 的商标。

与罗丹明123 <Rh123> 或tetramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同,在用固定剂破坏膜电位后,MitoTracker®不会被洗掉。

依据线粒体染色剂,还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室,这类染料被称为LysoTracker。

它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成,具有膜穿透性。

最有可能的情况是,这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。

LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择〔参见表1。

与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡,这种膜密闭空间也是一种酸性环境。

如果要在荧光显微镜下观察上述区室,则要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。

对于蛋白质分泌实验,质网<ER> 具有重要的研究意义。

对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6<3>。

该染料虽然偏好ER,但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。

对ER 进行特异性染色的另一种方法是,使用ER-Tracker Green 和Red 等ER-Tracker,而ER-Tracker Green 和Red 是基于BODIPY 的两种染料,其与格列本脲〔一种磺酰基脲酶连接,并可与仅存于质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。

BODIPY〔硼-二吡咯亚甲基,boron-dipyrromethene是一种几乎不溶于水的、对pH 相对不敏感的染料基团,该染料对蛋白质标记没太大用处,但却是脂质和膜标记的良好工具。

对于与ER相邻的高尔基体,可以用NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。

上述神经酰胺为鞘脂类,其在高尔基体中高度富集。

借助基于脂质的染料,可以对脂筏等特异膜区域进行染色。

使用NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以观察胆固醇富集区域〔Avanti Polar Lipids。

除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外,还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。

这些蛋白质可以和荧光染料相连,并可通过荧光显微镜进行观察。

运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素<WGA> 可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合,将WGA 与荧光染料偶联,这样我们就可以观察到细胞质膜了。

图4：Pukinje细胞,小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。

红色：anti—calbindinD28k/Cy3；绿色：anti-GFAP/Cy5；蓝色：Hoechst 33258
图5：牛肺部皮细胞。

红色：用MitoTracker®Red CMXRos 标记的线粒体；绿色：用绿色荧光BODIPY®FLphallacidin 标记的纤维状肌动蛋白；蓝色：用DAPI 标记的细胞核。

使用三维盲反褶积可以改善该图像的质量。

7离子成像
在有关神经元方面的研究中,观察基因活性或细胞运动等对于了解细胞的离子浓度具有重要意义。

钠、钙、氯或镁离子对很多不同的细胞活动都具有较大影响。

一般情况下,借助荧光标记的螯合剂可将离子困住,螯合剂在结合相应离子后会改变离子的光谱特性。

例如,利用该原理的钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。

对于钠离子的检测,通常使用SBFI <sodium-bindingbenzofurzanisophthalate> 或Sodium Green。

PBFI<potassium-binding benzofurzanisophthalate> 可以检测钾离子。

有趣的是,还存在以蛋白质为主的钙指示剂,其中一种是基于水母化学发光蛋白—水母素。

水母素、发光体腔肠素、分子氧和Ca2+的相互作用会释放蓝光,这是在荧光蛋白质的发现过程中非常著名的机制。

8生产实践
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