发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性B细胞抗原决定簇的预..

第!"卷!第#期"$%&年'月
病!!毒!!学!!报()*+,-,./01+23/45*1/3/67
589:!"!+8:#-;<
=;>?;@"$%&发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性
T 细胞抗原决定簇的预测与确定
陈军% 孙培蓓% 张锋% 顾春燕% 高孟% 倪红霞" 罗永能%"
!%:浙江省医学科学院病毒病研究所"杭州!%$$%!#":宁波市疾病预防控制中心病毒研究所"宁波!%#$%$$摘要 为了确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒!-;Q ;@;K ;Q ;@e N =F =F @8>?8H Y =8<;E N G M Y E I @8>;Q N @L M "-4V -5$核衣壳蛋白!+蛋白$的优势线性U 细胞抗原决定簇位点"本文根据线性U 细胞抗原表位拥有较强的抗原性'亲水性以及表面性等特点"运用生物信息学软件分析-4V -5+蛋白的氨基酸序列"预测潜在的线性U 细胞抗原决定簇位点%根据已解析的-4V -5+蛋白晶体结构"使用O Y
R/3软件分析预测出的线性U 细胞抗原决定簇位点的柔性及其在整个-4V -5+蛋白中的分布情况%人工合成相应多肽片段并以其为抗原"与-4V -5临床感染者的血清反应"采用多肽P 酶联免疫吸附检测法检验多肽片段的免疫原性%结果共预测出六个可能的线性U 细胞抗原决定簇位点"即2!A $P \\3\,V 66[[d5\[V \P ##$'U !D %P 2-6\R -+-6-\13P C !$'(!'A P ,12,V 13P %$$$'[!%!#P 3\5,+7O O P %A "$',!%#D P65-,2V V P %&!$和4!%C A P \R 162-\V ,57+-41[O P "$$$"均位于+蛋白表面且含有柔性较大的988<区%相应的六段人工合成多肽都与-4V -5临床病例血清呈阳性反应"确定它们均为优势线性U 细胞抗原决定簇位点"其各自检测结果与商品化+蛋白抗体检测试剂盒相应检测结果进行线性回归分析表明呈正相关%综合运用上述多种方法"本研究成功地预测并确定了-4V -5+蛋白的线性U 细胞抗原决定簇位点"为该病毒抗原特异性的分子基础研究以及相关疾病的诊断和治疗奠定了基础%
关键词 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒!-4V -5$#核衣壳蛋白!+蛋白$#线性U 细胞抗原决定簇#多肽P 酶联免疫吸附检测
中图分类号 1!D !:'!!文献标识码 2!!文章编号 %$$$P C D "% "$%& $#P $#'D P $&
收稿日期 "$%#P %%P $! 修回日期 "$%&P $&P "D
基金项目 浙江省医药卫生平台重点资助计划项目!项目号&"$%!S [2$$&
$#浙江省重点实验室科技计划项目!项目号&"$$C 4!$""
$作者简介 陈军!%'D "P $"男!汉族$"浙江省医学科学院病毒病研究所"实验师"从事医学病毒学研究"V ;9&TC &P #D %P C 'C '$"#&",P >G N 9&%!#C C C $!#C D !%&!:H 8>
"通讯作者 罗永能!%'&&P $"研究员"从事医学病毒学研究"V ;9&T C &P #D %P C 'C '$"D D ",P >G N 9&Y
E 9%$%!%&!:H 8>!!发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒
!-4V -5$是布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒"主要由蜱虫叮咬传播%近年来"在辽宁'湖北'山东'
河南'江苏'安徽'浙江等地均出现感染发热伴血小板减少综合征病毒的病例"患者临床上表现为起热急'乏力'恶心'呕吐等症状"伴有血小板减少'白细胞减少"
部分病例有头痛甚至出血等症状"少数重症患者因多器官衰竭而死亡"病死率约为%$X %
该病毒为单股负链1+2病毒"其基因组由大片段!3$'中片段!R $'小片段!-$三个基因片段组成%核衣壳蛋白!+蛋白$由-片段编码"包裹基因组1+2"
形成核糖核蛋白复合物"在基因转录'复制以及病毒组装过程中起重要作用(%P !)%许多实验证
明+蛋白具有良好的抗原性"
能够诱导机体产生特异性抗体(A P &
)"从而可用于相应检测试剂或诊断试剂
的研发%
本文应用生物信息学软件分析-4V -5+蛋白的序列和结构"预测潜在线性U 细胞抗原决定簇位点"分析其在整个+蛋白中的分布情况%人工合成相应多肽片段"与明确感染-4V -5的病人血清反应"从而确定-4V -5+蛋白线性U 细胞抗原决定簇位点"为相关抗体制备'疾病诊断以及疫苗研发等奠定基础%
材料与方法
%!材料与试剂!病例血清由宁波市疾病预防控制
中心病毒室提供#人工合成多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司提供#-4V -5+蛋白抗体检测,*2*,3*-2试剂盒购自无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司#'&孔酶标板购自H 8M =G @公司#)1O 标记的羊抗人*J
6抗体购自北京康为世纪%&!线性T 细胞抗原决定簇的预测!使用[+2-=G @
O @8=;G E 程序分析-4V -5)U "'株的+蛋白序列"采用.G >;M 8E P d 89K 法预测其抗原性!2E =N J ;E N H *E P I ;]$"\Y =;P [889N ==9;法预测其亲水性!)Y I @8<
F N 9N H P N =Y O
98=$",>N E N 法预测其表面性!-L @K G H ;O @8?G ?N 9P N =Y O
98=$%由于线性U 细胞抗原决定簇拥有较强的网络出版时间：2016-09-12 22:41:58网络出版地址：/kcms/detail/11.1865.r.20160912.2241.020.html
抗原性'亲水性以及表面性"因此可以推测出潜在的线性U细胞抗原决定簇位点%使用U;<N O@;I软件结合氨基酸性质和隐形马尔可夫模型来进一步验证预测出的线性U细胞抗原决定簇位点%
'!潜在线性T细胞抗原决定簇在Q#/Q)S蛋白中的分布情况!根据已解析的-4V-5的+蛋白晶体结构!O[U&A.A1$"使用O Y R/3软件进行分析"查看预测出的线性U细胞抗原决定簇在-4V-5+蛋白中的分布情况%
*!实验血清抗体检测!使用无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司生产的-4V-5核衣壳蛋白抗体检测,*2*,3*-2试剂盒检测各个病例血清中是否含有相应抗体%按照试剂盒操作说明"首先取出用重组+蛋白包被好的酶联反应板"阴性对照'阳性对照'稀释后的病例血清和正常人血清各%$$+3加入相应孔内"!D b孵育%F"洗涤!次#各孔加入)1O标记的重组布尼亚病毒蛋白工作液%$$+3"!Db孵育%F"洗涤!次#各孔加入显色液2'U各#$+3"轻拍混匀后!D b孵育%$>N E#每孔加入终止液#$+3"震荡%$M混匀"用酶标仪测定A#$E>的吸光度值%结果判定时H L=8K Kn$B$#`"B%n$B%$##样本/[A#$E>%H L=8K K值为阳性"否则为阴性%选取结果为阳性的病例血清进行后续多肽P酶联免疫吸附检测实验"结果为阴性的正常人血清作为后续实验的对照%
0!多肽-酶联免疫吸附检测!人工合成包含潜在线性U细胞抗原决定簇位点的多肽"以各个多肽作为检测抗原直接捕获感染-4V-5病人的血清样品中的特异性*J6抗体"正常人血清为对照%首先用包被缓冲液将各多肽稀释至%$+J*>3"以%$$+3*孔的量包被于'&孔酶标板中"A b过夜"洗板!次#每孔加入"$$+3含有%X牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭"!D b孵育%F"洗板!次#用稀释液将血清样品稀释%$$倍后加入各孔"每孔%$$+3"同时设立阴性对照孔和空白孔"!D b孵育%F"洗板!次#将)1O标记的羊抗人*J6抗体用稀释液稀释#$$$倍"每孔%$$+3"!D b孵育!$>N E"洗板!次#加入/O[显色液每孔%$$+3"避光放置"$>N E#加入"R硫酸每孔%$$+3终止反应"用酶标仪测定A'$E>的吸光度值%以O*+比值法判定结果"实验组吸光度值*对照组吸光度值%"B%为阳性"否则为阴性%包被缓冲液&+G
"(/!%B#'J
*3"+G)(/
! "B'!J*3"<)'B&%磷酸盐缓冲液&+G(9C B$J*3" \)"O/A$B"J*3"+G")O/A+%")"/"B'J*3" \(9$B"J*3"<)D B A%
结!!果
%!Q#/Q)S蛋白的优势线性T细胞抗原决定簇预测
通过[+2-=G@O@8=;G E程序分析"-4V-5+蛋白氨基酸序列的抗原性'亲水性和表面性结果所示三种指数的读数较高"为可能的线性U细胞抗原决定簇位点%
使用U;<N O@;I软件分析-4V-5+蛋白序列"结果显示A!"#"'D!"C$'%!C"%A"'%##"%&!'%C& "%'&'""A""!D为可能的线性U细胞抗原决定簇位点"该结果与O@8=;G E程序预测的位点部分重叠%综合上述结果"最终选取抗原性'亲水性和表面性指数较高的&个多肽片段作为潜在的线性U细胞抗原决定簇"计算各指数的加权平均值%表%为预测出来的多肽片段相关信息%
表%!Q#/Q)S蛋白的线性T细胞抗原决定簇预测结果
V G?9;%!O@;I N H=N8E8K9N E;G@UH;99;<N=8<;M N E=F;-4V-5E L H9;8H G<M N I<@8=;N E
O;<=N I;M-N=;M2>N E82H N I-;W L;E H;M2E=N J;E N H*E I;])Y I@8<F N9N H N=Y-L@K G H;O@8?G?N9N=Y 2A$P##\\3\,V66[[d5\[V\%B A&!$B C D D%B A A!
U D%P C!2-6\R-+-6-\13%B##C$B D"#%B""# ('A P%$$,12,V13$B D$D$B#D$%B#A A [%!#P%A"3\5,+7O O%B!A A$B C$!%B'%!
,%#D P%&!65-,2V V$B&#D$B$&$%B%&D 4%C A P"$$\R162-\V,57+-41[O%B#!A$B'&%%B A D D
&!潜在线性T细胞抗原决定簇在Q#/Q)S蛋白中的分布情况
通过对-4V-5+蛋白结构!O[U&A.A1$进行分析"发现预测出来的潜在线性U细胞抗原决定簇均分布于+蛋白表面"且包含柔性较大的988<区!图%$"符合抗原决定簇处于蛋白结构表面"柔性高等特点%
+
C
'
#
+病!!毒!!学!!报!"卷!
图%
!线性T 细胞抗原决定簇在Q #/Q )S 蛋白中的分布情况 $,T *Z *6 黑色为S 蛋白单体 灰色为潜在线性T 细胞抗原决定簇 右侧为S 蛋白六聚体
4N J L @;%![N M =@N ?L =N 8E8K 9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M N E =F ;-4V -5E L H 9;8H G <
M N I <@8=;N E !O [U &A .A 1$B +L H 9;8H G <M N I <@8=;N E>8E 8>;@!?9G H Z $"<8M M N ?9;9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M !J @G Y $"E L H 9;8H G <M N I <@8=;N EF ;]G >;@!@N J
F =$'!实验血清检测结果
共有%"位临床感染-4V -5病例的血清经过无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司-4V -5核衣壳蛋白抗体检测,*2*,3*-2试剂盒的检测"结果均为阳性"充分证明其血清中含有抗-4V -5+蛋白的抗体"
可用于后续实验#而&位与确证感染病例年龄相仿的正常人血清!(8E =@89$使用该试剂盒检测"结果为阴性"可作为后续实验的对照%检测结果统计见图"的+O @8=;N E
!鑫连鑫$栏%*!多肽-!U M Q 8检测Q #/Q )S 蛋白中各线性T 细胞抗原决定簇位点的免疫显性
人工合成包含线性U 细胞抗原决定簇位点的多肽片段"采用多肽P ,3*-2方法检验各个多肽是否与明确感染-4V -5病例的血清产生反应"并用正常人的血清作为对照%多肽P ,3*-2结果如图"所示%可以看到"各多肽片段与病例血清和正常人血清的反应有明显差别%
计算O *+值!病例血清吸光度值*正常人血清吸光度值$
并对结果进行统计分析"发现所有2"4六个多肽肽段的O *+值$"B %"为阳性结果"说明其免疫原性都较强#其中U 和4多肽肽段的免疫原性更显著!图!$%因此确定2"4六段多肽片段均为-4V -5+蛋白的优势线性U 细胞抗原决定簇位点%
将上述多肽P ,3*-2与商品化的鑫连鑫公司-4V -5+蛋白抗体检测,*2*,3*-2试剂盒的检
图&!Q #/Q )S 蛋白 鑫连鑫 的!M 8结果和预测的线性T 细胞抗原决定簇多肽肽段与Q #/Q )病例血清的
多肽-!U M Q 8结果
4N J L @;"!-4V -5E L H 9;8H G <M N I <@8=;N E P ,*2G E I O ;<=N I ;P ,3*-2@;M L 9=M 8K <@;I N H =;I 9N E ;G @UH ;99;<N =8<
;M e N =FM ;@G M G ><
9;M 8K -4V -5<G =N ;E =M 测结果进行线性回归分析"可见包被2"4各肽段和+蛋白作为捕获抗原检测相应抗体测得的/[
值之间均为正相关!趋势线向上倾斜$!图A $%
讨!!论
-4V -5是布尼亚病毒科白蛉病毒属新发现的
+''#+!#期!!陈军等&
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性U 细胞抗原决定簇的预测与确定
图'!多肽-!U M Q 8
的$ S 值统计结果
4N J L @;!!-=G =N M =N H G 9O *+@;M L 9=M 8K <;<
=N I ;P ,3*-2病毒"致病性高"多发于农村地区"病患年龄较大"目前尚无针对该病毒的特效药或疫苗%因此对该病毒编码的结构蛋白和非结构蛋白进行结构与功能方面的研究有助于检测试剂'
特异性药物和相关疫苗等研制"
为该病毒及其感染导致疾病的诊断和治疗提供基础%而作为结构蛋白之一的+蛋白也是-4V -5主要的免疫原成分"
虽然不含中和抗原表位"但能在感染早期诱导机体产生高水平的特异性*J R 抗体和*J
6抗体%因此"可以利用大肠杆菌重组表达并纯化的-4V -5+蛋白作为抗原捕获和检
测人和动物血清中的特异性目标抗体(D
)%同时"也
可研制相应的单克隆抗体并用于-4V -5病毒或其
+蛋白等抗原的检测"
例如刘林等(&)
制备获得了特异性识别-4V -5+蛋白的单克隆抗体"
并结合兔抗-4V -5全病毒多克隆抗体建立了可测定-4V -5病毒滴度的双抗体夹心,3*-2方法%上述
相应的检测-4V -5抗原或抗体的,3*-2试剂盒也已在国内商品化%然而"这些检测试剂盒是针对
+蛋白或其特异性抗体"
在具体应用和相关结果分析时尤其应当注意其与其它方法检测对象不同导致
的结果差异%胡逢蛟等(C )
用此,3*-2试剂盒'
间接免疫荧光!*42$和微量中和试验!R+V $三种方法来检测体检人群血清中的-4V -5抗体"结果表明*42!针对-4V -5全病毒$
和R+V !针对病毒包膜糖蛋白刺激机体产生的中和抗体$检测结果之间阳性符合率较高"它们与,3*-2!针对+蛋白$检测结果符合率较低%
图*!8 #各肽段的多肽-!U M Q 8和S 蛋白-!M 8 鑫连鑫 检测结果的线性回归分析4N J L @;A !3N E ;G @@;J @;M M N 8EG E G 9Y M N M 8K2"4<;<
=N I ;P ,3*-2G E I+<@8=;N E P ,*2@;M L 9=M !!另一方面"
对-4V -5+蛋白晶体结构的解析显示其序列大部分折叠成一个紧密核心区"+端臂
延伸在外并介导多聚体如六聚体等的形成(')%+蛋
白结构表面具有与1+2结合的带正电凹穴'+端臂结合槽纹和多聚化结合位点等%+蛋白1&A [
*\&D [*\D A [三重突变体基本丧失了体外结合
1+2能力"
进而影响转录和复制%小分子药物筛选发现苏拉明!-L @G >N E $能有效抑制-4V -5在5;@8细胞中的增殖"而对两者结合物晶体结构的解析发现苏拉明结合位点与1+2结合的凹穴部位重
+
$$&+病!!毒!!学!!报!"卷!
合(')%由于与1+2结合的凹穴部位序列在白蛉病毒属多个成员包括-4V-5的+蛋白中高度保守"苏拉明可能用作治疗和扼制这些白蛉病毒感染的有效工具(')%
目前关于-4V-5抗原决定簇位点的研究还不是很多%李阿茜等人(%$)用灭活纯化的-4V-5病毒颗粒作为免疫原制备获得了多株分别针对-4V-5 +蛋白和包膜糖蛋白的小鼠单克隆抗体"然而它们相应的U细胞抗原表位尚未确定%7L3等使用三维结构分子模拟预测并用人源和小鼠单克隆抗体验证确定了A个U细胞抗原决定簇位点"分别为%!# "%#位氨基酸$'"!!#"A#位氨基酸$'!!%!""%A"位氨基酸和A!"!#""A#位氨基酸$(%%)%本文首先采用生物信息学方法预测出-4V-5)U"'株+蛋白的&个潜在线性U细胞抗原决定簇位点2"4"并通过对+蛋白晶体结构!O[U&A.A1$(')的分析"确定它们普遍分布在+蛋白的表面"且柔性较大%在前期工作基础上"我们分析了各个病例的血清信息"选取-4V-5核衣壳蛋白特异性抗体检测明确为阳性的病例血清"用于多肽P,3*-2进一步验证其与上述包含线性U细胞抗原决定簇位点的人工合成肽段的反应程度"结果显示所有2"4&个线性U细胞抗原决定簇位点的免疫原性均较强"为优势位点"其中U和4多肽肽段的免疫原性更显著%此外"由于无锡鑫连鑫公司生产的-4V-5+蛋白抗体,3*-2检测试剂盒所包被的抗原是+蛋白"其检测信号来自于+蛋白中所有U细胞抗原表位包括线性和构象性表位所诱导的抗体"而我们所用多肽P,3*-2所包被抗原是包含某一特定线性U细胞抗原表位的肽段"检测信号来自于这一特定肽段所诱导的抗体#并且不同-4V-5病人的个体免疫差异可能导致其血清中针对不同或同一U细胞抗原表位的特异性抗体的含量和比例不一%因此"上述因素很可能导致两种方法在对同一病例血清检测时的信号差异%
上述线性U细胞抗原决定簇中"2片段和[片段分别与7L3等确定的U细胞抗原表位"和!部分重叠(%%)#U片段也与苏拉明结合位点(')部分重叠"其中\D A也是苏拉明结合位点中的重要氨基酸"提示该位点诱导的抗体也可能抑制-4V-5病毒1+2的转录和复制%先前"我们已使用类似的方法成功预测和确定了,5D%)!P V7株和柯萨奇病毒2%&型的衣壳蛋白5O%"5O!上的线性U细胞抗原决定簇位点(%"P%!)%综合考虑"我们所采用的预测方法以及实验验证手段能够有效确定不同病毒的线性U细胞抗原决定簇位点"为相应特异性抗原或抗体诊断以及相关病毒类多肽疫苗等研究提供启示%
参考文献
(%)3N L-"(F G N("d G E J("2>;@-"3Q)");)"-L E."
3N E.:-Y M=;>G=N H@;Q N;e8K M;Q;@;K;Q;@e N=F=F@8>?8H Y P =8<;E N GM Y E I@8>;&Q N@898J Y";<N I;>N898J Y"G E IH9N E N H G9
H F G@G H=;@N M=N H M(.):1;Q R;I5N@89""$%A""A!"$&'$P
%$":
(")3;N^7"3N L R R"G E I7L^.:-;Q;@;K;Q;@e N=F =F@8>?8H Y=8<;E N GM Y E I@8>;G E IN=M<G=F8J;E-4V-5 (.):R N H@8?;M*E K;H=""$%#"%D!"$&%A'P%#A:
(!)3N[:2F N J F9Y<G=F8J;E N HE;e?L E Y G Q N@L M;>;@J;IN E
(F N E G(.):,>;@J R N H@8?;M*E K;H=""$%!""!%$&;%: (A)徐言"曾晓燕"焦永军"张国强"张黎"罗兰"金秋"张
建平"史智扬:发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用(.):免疫学杂志""$%"""C!A$&"C"P"C#:
(#)刘林"张全福"李川"李建东"姜晓林"张福顺"芜为"
梁米芳"李德新:建立基于核蛋白双抗体夹心,3*-2的发热伴血小板减少综合征病毒滴定方法(.):中华实验和临床病毒学杂志""$%!""D!!$&"%#P"%D:
(&)李阿茜"刘林"张硕"李川"张全福"梁米芳"李德新:发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究(.):病毒学报""$%#"!%!!$&"!'P"A A: (D).N G87"S;E J^"6L8^"_N^"S F G E J^"-F N S"S F8L
R"U G8("S F G E J d"^L7"d G E J):O@;<G@G=N8EG E I ;Q G9L G=N8E8K@;H8>?N E G E=M;Q;@;K;Q;@e N=F=F@8>?8H Y P =8<;E N GM Y E I@8>;Q N@L ME L H9;8H G<M N I<@8=;N EK8@I;=;H P =N8E8K=8=G9G E=N?8I N;MN E F L>G EG E IG E N>G9M;@G?Y I8L?9;P G E=N J;EM G E I e N H F;E a Y>;P9N E Z;IN>>L E8M8@?;E=
G M M G Y(.):.(9N E R N H@8?N89""$%""#$!"$&!D"P!D D: (C)胡逢蛟"焦素黎"倪红霞"易波"李永东:间接免疫荧光
法在健康人群新布尼亚病毒抗体检测中的应用(.):国际流行病学传染病杂志""$%A"A%!A$&"!!P"!&: (').N G83"/L Y G E J-"3N G E J R"+N L4"-F G e+"d L d"
[N E J d".N E("O;E J7"S F L7"S F G E J4"d G E J V"3N ("S L8^"3L G E()"3N["3N LS.:-=@L H=L@;8K M;Q;@;
K;Q;@e N=F=F@8>?8H Y=8<;E N GM Y E I@8>;Q N@L ME L H9;8H G<P M N I<@8=;N E N EH8><9;]e N=FM L@G>N E@;Q;G9M=F;@G<;L=N H <8=;E=N G9(.):.5N@89""$%!"C D!%"$&&C"'P&C!':
(%$)李阿茜"刘林"张硕"李川"张全福"梁米芳"李德新:抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体
的制备和功能分析(.):病毒学报""$%#"!%!%$&%C P "!:
(%%)7L3"S F G E J3"-L E3"3L."d Ld"3N("S F G E J_"
+
%
$
&
+
!#期!!陈军等&发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性U细胞抗原决定簇的预测与确定
S F G E J 4".N E("d G E J ^"U N S "3N ["3N G E J R:(@N =N P H G 9;<N =8<;M N E=F ;E L H 9;8H G <M N I <@8=;N E8K-4V -Q N @L M @;H 8J E N a ;I?Y G <G E ;98K-4V -<G =N ;E =MI ;@N Q ;IF L >G E >8E 8H 98E G 9G E =N ?8I N ;M (.*/3):O 38-/E ;""$%""D !&$&;!C "'%:
(%")高丽美"高孟"王静华"唐彩华"罗永能:肠道病毒D %
型)!P V 7株衣壳蛋白5O %"5O !的优势线性U 细胞
抗原决定簇预测与确定(.):中国卫生检验杂志""$%A ""A !""$&!%'!P !%'#:
(%!
)高孟"倪红霞"朱莲"李剑波"高丽美"罗永能:柯萨奇病毒2%&型衣壳蛋白5O %"5O !的U 淋巴细胞线性抗原表位预测与确定(.):中华临床感染病杂志""$%#"C $!&$&#"&P #!%:
$>;K E D =E B ?H ?K M K ;?=E F E D H =E B ?B F M G G C ?B K B G E ?H ?=U E ?;H >T5;A A !1E =B 1;<E ?=J ;S C D A ;B D H 1
<E K$>B =;E ?B F Q #/Q )(),+.L E %"-0+O ;N ?;N %"S )2+64;E J %"60(F L E Y
G E %
"62/R ;E J %"+*)8E J ]N G ""30/78E J E ;E J %
"
!%O >5"2.212&;<J .:)+C ."&)"&""S %&R .)57@/)-&63;<,&-./)+!/.&5/&""I )57
N %;1!%$$%!"*%.5)#"O $.57(;,15./.#)+*&52:&<;:C ."&)"&*;52:;+)5-A :&9&52.;5"$.57
(;!%#$%$"*%.5)$8@<=>H D =&*E8@I ;@=8N I ;E =N K Y N >>L E 8I 8>N E G E =9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M N E =F ;E L H 9;8H G <M N I <@8=;N E+8K M ;Q ;@;K ;Q ;@e N =F =F @8>?8H Y =8<;E N G M Y E I @8>;Q N @L M !-4V -5$"?N 8N E K 8@>G =N H M <@8J @G >Me ;@;L M ;I =8G E G 9Y a ;G E P =N J ;E N H N =Y "F Y I @8<F N 9N H N =Y G E IM L @K G H ;<@8?G ?N 9N =Y 8K =F ;G >N E 8G H N IM ;W L ;E H ;G E I <@;I N H =<8M M N ?9;9N E ;G @U H ;99;<N =8<;M :O Y R/3M 8K =e G @;e G M L M ;I =8G E G 9Y a ;=F ;I N M =@N ?L =N 8E8K 9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M N EE L H 9;8H G <M N I <@8=;N E+?G M ;I8E N =M H @Y M =G 9M =@L H =L @;:(8@@;M <8E I N E J<;<=N I ;Me ;@;M Y E =F ;M N a ;IG E I;]G >N E ;I N E <;<
=N I ;;E a Y >;P 9N E Z ;I N >>L E 8M 8@?;E =G M M G Y !O ;<=N I ;P ,3*-2$N E I N Q N I L G 99Y =8H F ;H Ze F ;=F ;@=F ;Y @;G H =;Ie N =F M ;@G K @8>-4V -5P N E K ;H =;I <G =N ;E =M :2M G @;M L 9="G =8=G 98K M N ]<8=;E =N G 99N E ;G @UH ;99;<N =8<
;Me ;@;<@;I N H =;IG M =F ;K 8998e N E J &2!A $P \\3\,V 66[[d5\[V \P ##$"U !D %P 2-6\R -+-6-\13P C !$"(!'A P ,12,V 13P %$$$"[!%!#P 3\5,+7O O P %A "$",!%#D P 65-,2V V P %&!$G E I4!%C A P \R162-\V ,57+-P 41[O P "$$$B 299;<N =8<;Me ;@;98H G =;I8E =F ;M L @K G H ;8K =F ;E L H 9;8H G <M N I <@8=;N E+G E IH 8E =G N E ;I K 9;]N ?9;988<M B ,G H F8K =F ;M N ]M Y E =F ;=N H <;<=N I ;M@;G H =;I <8M N =N Q ;9Y e N =FM ;@GK @8>-4V -5P N E K ;H =;I <G =N ;E =MG E I e ;@;N I ;E =N K N ;I G M N >>L E 8I 8>N E G E =9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M B 3N E ;G @@;J @;M M N 8E G E G 9Y
M N M M F 8e ;I G <8M N =N Q ;H 8@P @;9G =N 8E?;=e ;;E ;G H F <;<=N I ;P ,3*-2G E I H 8>>;@H N G 9N a ;I+<@8=;N E P ?G M ;I,*2B *E =F N M M =L I Y "N >>L E 8I 8>P N E G E =9N E ;G @UH ;99;<N =8<;M K @8>=F ;E L H 9;8H G <M N I <@8=;N E+8K -4V -5e ;@;M L H H ;M M K L 99Y<@;I N H =;I G E I H 8E P K N @>;I B V F ;M ;K N E I N E J M>G Y F ;9<=8;M =G ?9N M F =F ;>89;H L 9;?G M N M 8K M <;H N K N H G E =N J ;E N H N =Y G E II N M ;G M ;I N G J E 8P M N M B
P ;O L
B >K <&-;Q ;@;K ;Q ;@e N =F =F @8>?8H Y =8<;E N G M Y E I @8>;Q N @L M !-4V -5$#+L H 9;8H G <M N I <@8=;N E #3N E ;G @U H ;99;<N =8<
;M #O ;<=N I ;;E a Y >;P 9N E Z ;I N >>L E 8M 8@?;E =G M M G Y !O ;<=N I ;P ,3*-2$"*;::&"#;5-.57)12%;:&D 8PE ;575&57"
F L 6).+&35+%$%!%&!O /;6+
"$&+病!!毒!!学!!报!"卷!。