利用ssr标记浅析云南登革热重点地区埃及伊蚊种群遗传特征

中国人兽共患病学报
C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s
㊀
２０２１,３７(２
)D O I :１０．３９６９/j
．i s s n ．１００２－２６９４．２０２１．００．０１４ 调查研究
利用s s r 标记浅析云南登革热重点地区
埃及伊蚊种群遗传特征
郑宇婷１,姜进勇１,周红宁１,马雅军２
国家自然科学基金(N o ．U I ６０２２２３),国家重点研发计划(N o ．２０１６Y F C １２００５００
)联合资助通讯作者:姜进勇,E m a i l :j i a n g j i n y o n g ＠y i p d ．o r g
;O R C I D :００００Ｇ０００１Ｇ７８９１Ｇ１２５９
作者单位:１．
云南省虫媒传染病防控关键技术创新团队(培育)云南省虫媒传染病防控研究重点实验室面向南亚东南亚热带病国际科技人员教育培训基地云南省虫媒病毒研究中心,普洱６６５０００;
２．
第二军医大学热带医学与公共卫生学系热带传染病学教研室,上海㊀２００４３３摘㊀要:目的㊀通过研究云南省不同地理来源的埃及伊蚊自然种群遗传结构,探究不同群体间的遗传特征与联系.方法
捕获景洪㊁勐腊㊁勐海㊁耿马㊁瑞丽的埃及伊蚊,提取D N A 并采用１２对荧光标记的微卫星引物进行P C R 扩增,用毛细管电泳检测扩增片段,分析５个埃及伊蚊自然种群的遗传相关指标.结果㊀在５个采集点共采集２３４个有伊蚊幼虫的容器,采集埃及伊蚊６０３只,随机选取１４９只提取D N A ,进行扩增分析.１２个微卫星位点的平均N a ㊁N e ㊁
H o ㊁H e ㊁P I C 分别为１８㊁４．６５３㊁０ ７１１㊁０．７２８㊁０．７７８,１２个微卫星位点的P I C 指数均＞０．２５,高度多态.每个种群的平均N a ㊁N e ㊁H o ㊁H e ㊁P I C 分别为７．７５０~１０．５８３㊁３．６０６~５．３０９㊁０．６６１~０．７４１㊁０．６２９~０．７７４㊁０．５８８~０．７５０.１２个微卫星位点的F s t ,F i s ,N m 的平均值分别为０．０７８㊁０ ０２８㊁３．３２１.５个自然种群埃及伊蚊的成对指数F a s t 为０．０５７~０．１４８,各种群间遗传分化和地理距离未发现显著相关,N e i s 标准遗传距离在０．１６２~０．５２７之间,对应的遗传相似度在０．５９０~０．８５０之间.结论㊀云南省埃及伊蚊遗传多样性比较丰富,
种群间存在一定的遗传分化和基因交流.
关键词:微卫星;埃及伊蚊;遗传特征
中图分类号:R ３７８．５㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０２－０１７６－０７
A n a l y s i s o f A e d e s a e g y p t i p o p
u l a t i o n g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s i nk e y a r e a s o f d e n g u e f e v e r i nY u n n a nP r o v i n c e b y s
s rm a r k e r s Z H E N G Y u Ｇt i n g １,J I A N GJ i n Ｇy o n g １,Z HO U H o n g Ｇn i n g １,MA Y a Ｇj
u n ２
(１．I n n o v a t i v eT e a mo f K e y T e c h n i q u e s f
o rV e c t o rB o r n eD i s e a s eC o n t r o l a n d P r e v e n t i o n (D e v e l o p i n g ),Y u n n a nP r o v i n c i a lC e n t e r o f A
r b o r v i r u sR e s e a r c h ,Y u n n a nP r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f V e c t o r Ｇb o r n eD i s e a s e sC o n t r o l a n dR e s e a r c h ,T r a i n i n g B a s e o f I
n t e r n a t i o n a l S c i e n t i f i cE x c h a n g e a n dE d u c a t i o n i nT r o p i c a lD i s e a s e s f
o rS o u t ha n dS o u t h e a s tA s i a ,P u e r ６６５０００,C h i n a ;２．D e p a r t m e n t o f T r o p i c a l I n f e c t i o u sD i s e a s e s ,F a c u l t y o f T r o p
i c a lM e d i c i n e a n dP u b l i cH e a l t h ,S e c o n d M i l i t a r y M e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h a n g
h a i ２００４３３,C h i n a )A b s t r a c t :I n t h i s s t u d y ,w e a n a l y z e d t h e g e n e t i c v a r i a t i o n s i n A e d e s a e g y p
t i t o e x p l o r e t h e g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d c o n Ｇn e c t i o n sb e t w e e n p o p u l a t i o n s i nY u n a nP r o v i n c e ．A e ．a e g y p
t i s a m p l e sw e r e c o l l e c t e d f r o mJ i n g h o n g ,M e n g l a ,M e n g h a i ,G e n g Ｇm a a n dR u i l i ．F i r s t ,D N Aw a s e x t r a c t e d ,a n d t h e P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f １２f l u o r e s c e n t l y l a b e l e d s i m p l e s e q u e n c e r e p
e a t m a r k e r sw e r e d e t e c t e db y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ．At o t a l o
f ２３４c o n t a i n e r sw i t h l a r v a e a n d ６０３A e ．a e
g y p
t i w e r e c o l l e c t e d a t f i v e s i t e s ;１４９s a m p l e sw e r e r a n d o m l y s e l e c t e d f o r t h e e x p e r i m e n t ．W e a n a l y z e d t h e g e n e t i cd i v e r s i t y o f f i v e p o p u l a t i o n s ．T h e a v e r a g en u m b e r s o fN a ,N e ,H o ,H e a n dP I Co f １２m i c r o s a t e l l i t e l o c iw e r e １８,４．６５３,０．７１１,０．７２８a n d ０．７７８．T h e p o l y
m o r Ｇp
h i s mi n f o r m a t i o n c o n t e n t f o r a l l １２m i c r o s a t e l l i t e l o c iw a s＞０．２５．T h ea v e r a g
en u m b e r so fN a ,N e ,H o ,H ea n dP I Co f t h e f i v e p o p u l a t i o n sw e r e ７．７５０Ｇ１０．５８３,３．６０６Ｇ５．３０９,０．６６１Ｇ０．７４１,０．６２９Ｇ０．７７４a n d０．５８８Ｇ０．７５０．T h ea v e r a g en u m b e r so f F s t ,F i s a
n dN m f o r a l l １２m i c r o s a t e l l i t e l o c iw e r e ０．０７８,０．０２８a n d３ ３２１．T h e a v e r a g en u m b e r s o fF s t i n t h e f i v e p o p u l a t i o n s w e r e ０．０５７Ｇ０．１４８．A n i n s i g n i f i c a n t p o s i t i v e c o r r e l a t i o nw a s o b Ｇs e r v e d b e t w e e n p o p u l a t i o n g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o n a n d g e o Ｇg r a p h i c a l d i s t a n c e ．N e i s g e n e t i cd i s t a n c ea n d g e n e t i c i d e n t i t y w e r e ０．１６２Ｇ０ ５２７a n d ０．５９０Ｇ０．８５０．T h e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t ６
７１
t h ed e g r e e o f g e n e t i c p o l y m o r p h i s mi nY u n n a n A e．a e g y p t i i s h i g h,a n d g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o n a n d g e n e f l o we x i s t b e t w e e n p o pＧu l a t i o n s．
K e y w o r d s:m i c r o s a t e l l i t e;A e d e s a e g y p t;c h a r a c t e r i s t i c s
S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a(N o．U I６０２２２３)a n dN a t i o n a lK e y R e s e a r c ha n dD e v e l o p m e n t P r o g r a m(N o．２０１６Y F C１２００５００)
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:J i a n g J i nＧy o n g,E m a i l:j i a n g j i n y o n g＠y i p d．o r g
㊀㊀登革热(D e n g u e F e v e r)是登革病毒(D e n g u e v iＧr u s)经蚊媒传播引起的急性虫媒传染病,主要在热带和亚热带流行[１].１７７９年首次发现登革热病例[２],全球约２５亿人有感染登革病毒的危险,每年约有１亿新感染病例,其中５０万重症病例需住院治疗[３].我国最早在１８７３年厦门首次报道,１９９５年后呈局部暴发㊁输入性流行的特征[２],２００４年以来广东㊁福建㊁浙江等省份多次暴发本地疫情是我国重点防控区[４Ｇ６].与云南省接壤的越南㊁缅甸和老挝等国家为登革热常年流行区[７].云南省最早发现登革热病例是在１９７５年河口县[８],２００４年以来有散在输入病例报告,２００８年在德宏州芒市㊁临沧市镇康县首次报道云南省登革热本地病例[９Ｇ１０],２０１３年景洪市暴发登革热本地疫情[１０],此后我省西双版纳州景洪市㊁勐腊县㊁德宏州瑞丽市㊁临沧市耿马县等多次暴发流行,且流行日趋严重,登革热已经成为我省边境地区重要的虫媒传染病,严重危害边境地区人群健康.
埃及伊蚊(A e d e sa e g y p t i)是登革热的重要传播媒介,其传播能力远高于白纹伊蚊.埃及伊蚊为云南省的入侵蚊虫,２００２年首次在瑞丽市发现,其后１０余年间分布范围不断扩大,德宏州的芒市㊁陇川和盈江,西双版纳的景洪㊁勐腊㊁勐海,临沧市的耿马等３个州(市)㊁８个边境县(市)均有埃及伊蚊的分布[１１Ｇ１２].埃及伊蚊的入侵加剧了云南省登革热的暴发和流行风险.媒介控制是登革热防控的重要措施,研究埃及伊蚊的遗传特性,对登革热防控具有重要意义.
微卫星(S i m p l eS e q u e n c eR e p e a t,S S R)一般是由２~６个碱基为核心组成首尾相连的串联重复序列.D N A的滑动复制导致微卫星D N A长度多态性的产生,在埃及伊蚊种群特征的研究中,利用对核苷酸重复单位数目差异的研究来分析遗传相关的各项指标.微卫星因共显性遗传㊁高多态性和重复性好等特点,是研究蚊虫群体遗传结构理想的分子标记之一[１３],本研究采集云南省５个登革热重点县的埃及伊蚊,筛选１２个多态微卫星位点,通过微卫星D N A标记分析云南省５个不同地理来源的埃及伊蚊种群的亲缘关系群遗传多样性和遗传结构特征,对有效防制埃及伊蚊㊁科学防控登革热提供科学依据.
１㊀材料与方法
１．１㊀材料来源㊀依据埃及伊蚊入侵㊁定值和扩散的程度,选择云南省德宏州瑞丽市㊁西双版纳州景洪市㊁勐腊县㊁勐海县㊁临沧市耿马县作为调查地点,在埃及伊蚊蚊虫密度高峰季节,采集花瓶㊁轮胎㊁水桶㊁废弃瓶以及其他等容器中孳生的伊蚊幼虫,带回实验室根据不同的孳生容器分开饲养至羽化,形态学鉴定虫种[１４],并将鉴定出的埃及伊蚊保存于冻存管分装,单管单只.每个点采集根据采集方位和孳生容器随机抽取２９~３０只[１５]埃及伊蚊成蚊样本,确保采集样本覆盖每种孳生容器.低温冰箱保存待后续实验.
１．２㊀实验方法㊀样本单管单只成蚊,采用D N A提取试剂盒[T I A N a m p G e n o m i cD N A K i t(血液/细胞/组织基因组D N A提取试剂盒)(离心柱型)(含蛋白酶K)],按照试剂盒操作说明书提取蚊虫组D N A,并用超微量核酸分析仪(杭州奥盛仪器有限公司,N a n oＧ２００)检测浓度和纯度,通过查阅文献找出埃及伊蚊微卫星位点的侧翼序列[１６]设计１３对引物(表１).
对每个样本进行１３对引物的P C R扩增,反应体系共２５μL:１０∗E x T a q b u f f e r２．５μL,D N T P (２．５mm o l/L)２μL,M I X p r i m e r１μL(M I X p r i m e r 为正㊁反向引物等量混合),D N A模板１μL,E xT a q ０．２μL,H２O１８．３μL.反应条件为:９６ħ５m,９６ħ２０s,５３~５８ħ３０s,７２ħ３０s,１０个循环;９６ħ２０s,５２ħ３０s,７２ħ３０s,３０个循环;７２ħ５m.扩增产物毛细管电泳后得到原始数据(华大基因公司完成).
７７１
２期郑宇婷,等:利用s s r标记浅析云南登革热重点地区埃及伊蚊种群遗传特征
表１㊀埃及伊蚊１３个微卫星位点引物的相关信息
T a b．１㊀C h a r a c t e r i s t i c s o f１３m i c r o s a t e l l i t e l o c i o f A e．a e g y p t i
P r i m e r S e q u e n c e(５ᶄＧ３ᶄ)L e n g t h/b p L a b e l A T１A T１F C G T C G A C G T T A T C T C C T T G T T１５６Ｇ１７４F AM
A T１R G G A C C G G A A A G A C A C A G A C A
A G７A G７F C G T G C G A G T G A A T G A G A G A C１５３Ｇ１８５H E X
A G７R C A T C C T C T C A T C A G C T T C T A A T A A A
A G４A G４F A A A A C C T G C G C A A C A A T C A T１４７Ｇ１６９F AM
A G４R A A G G A C T C C G T A T A A T C G C A A C
A G２A G２F T C C C C T T T C A A A C C T A A T G G１１５Ｇ１７８F AM
A G２R T T T G C C C T C G T A T G C T C T C T
A C４A C４F G C G A A T C G G T T C C C A T A G T A１２８Ｇ１３０F AM
A C４R C T T T A T C G A T C G A C G C C A T T
A C２A C２F A A T A C A A C G C G A T C G A C T C C１７６Ｇ１９０R O X
A C２R A A C G A T T A G C T G C T C C G A A A
A G５A G５F T G A T C T T G A G A A G G C A T C C A１７０Ｇ１８０T AM R A
A G５R C G T T A T C C T T T C A T C A C T T G T T T G
A G３A G３F C G C C A A A A C T G A A A A C T G A A１６４Ｇ１７８H E X
A G３R A A G G G C G G T G A T G A C T T T C T
A C７A C７F T C G G C A A A T T A C C A C A A A C A１２９Ｇ１４３H E X
A C７R C A T T G G A C T C G C T A T A A C A C A C A
A C５A C５F T G G A T T G T T C T T A A C A A A C A C G A T１４９Ｇ１６３H E X
A C５R C G A T C T C A C T A C G G G T T T C G
A C１A C１F T C C G G T G G G T T A A G G A T A G A１９３Ｇ２０９R O X
A C１R A C T T C A C G C T C C A G C A A T C T
A G１A G１F A A T C C C C A C A C A A A C A C A C C１１３Ｇ１２９R O X
A G１R G G C C G T G G T G T T A C T C T C T C
C T２C T２F C G C A G T A G G C G A T A T T C G T T１８４Ｇ１９２R O X
C T２R A C C A C C A C C A A C A C C A T T C T
１．３㊀数据统计与分析㊀采用G e n e M a k e r(v e r s i o n２．２０)对原始数据进行分析处理,利用G e n A I E x６．５０３计算各基因座等位基因数(n u m b e ro f a l l e l e,N a)㊁有效等位基因数(e f f e c t i v en u m b e ro f a l l e l e,N e)㊁观测杂合度(o b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y,H o)㊁期望杂合度(e x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t y,H e)㊁群体内近交系数(p o p u l a t i o n i n b r e e d i n g c o e f f i c i e n t,F i s)㊁遗传分化系数(g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nc o e f f i c i e n t,F s t)㊁基因流(n u m b e r o fm i g r a n t s p e r g e n e r a t i o n,N m)以及N e i氏标准遗传距离(N e i ss t a n d a r d g e n e t i cd i sＧt a n c e)㊁遗传相似系数(N e i s s t a n d a r d g e n e t i c I d e nＧt i t y)等指标,并根据遗传分化和地理距离进行m a nＧt e l t e s t分析.使用P I CＧC A L C软件计算多态信息含量(p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o n c o n t e n t,P I C).利用A r l e q u i n３．５．１计算种群间成对固定指数F s t.２㊀结㊀果
２．１㊀蚊虫采集结果㊀２０１７年６月１日－２４日分别在瑞丽㊁勐腊㊁景洪㊁勐海㊁耿马采集伊蚊幼虫,并在显微镜下初步判定,收集埃及伊蚊幼虫并饲养至成蚊,共收集２３４个有伊蚊幼虫的容器,经鉴定饲养收集的埃及伊蚊有６０３只(表２).
不同孳生容器中随机选取１~１０只,总１４９只开展实验(表３).
８７１中国人兽共患病学报２０２１,３７(２)
表２㊀埃及伊蚊采样信息表
T a b．２㊀I n f o r m a t i o no n A e．a e g y p t i c o l l e c t i o n
C o l l e c t i o n r e g i o t C o l l e c t i o n
s i t e C o d e G e o g r a p h i c a l c o o r d i n a t e
C o l l e c t i o n
d a t e
T h e
c o n t a i n e r s
M o s q u i t o
s p e c i e s
A e．a e g y p t i
p o p u l a t i o n
西双版纳州瑞丽J H N２１ʎ２７ᶄＧ２２ʎ３６ᶄ,E１００ʎ２５ᶄＧ１０１ʎ３１ᶄ２０１７年６月
２１日－２９日４４
白纹伊蚊㊁
埃及伊蚊１
２４
西双版纳州勐腊M L N２１ʎ０９ᶄＧ２２ʎ２３ᶄ,E１０１ʎ０５ᶄＧ１０１ʎ５０ᶄ２０１７年６月
５日－６日２９
白纹伊蚊㊁
埃及伊蚊１
００
西双版纳州景洪MH N２１ʎ３８ᶄＧ２１ʎ５１ᶄ,E９９ʎ５７ᶄＧ１００ʎ１８ᶄ２０１７年６月
１日－１６日８２
白纹伊蚊㊁
埃及伊蚊２
７５
德宏州勐海R L N２３ʎ３８ᶄＧ２４ʎ１４ᶄ,E９７ʎ３１ᶄＧ９８ʎ０２ᶄ２０１７年６月
８日－９日３２
白纹伊蚊㊁
埃及伊蚊５
４
临沧市耿马GM N２３ʎ２７ᶄＧ２３ʎ４０ᶄ,E９８ʎ５３ᶄＧ９９ʎ１５ᶄ２０１７年６月
２０日－２４日４７
白纹伊蚊㊁
埃及伊蚊５
０
表３㊀选取埃及伊蚊实验样本信息表
T a b．３㊀S a m p l i n g i n f o r m a t i o n f o r A e．a e g y p t i
C o l l e c t i o n r e g i o t C o l l e c t i o n
s i t e C o d e S a m p l e s
t h e c o n t a i n e r s
V a s e t y r e b u c k e t D i s c a r d e db o t t l e s O t h e r c o n t a i n e r s
西双版纳州景洪J H２９５５１０３６西双版纳州勐腊M L３０１９８３９西双版纳州勐海MH３００７７８８德宏州瑞丽R L３０８７５６４临沧市耿马GM３０７８６４５合计１４９２１３６３６２４３２
２．２㊀毛细管电泳扩增的结果㊀样本D N A提取经超微量核酸提取仪检测后浓度在１６．５１~７７．８８n g/μL,经过毛细管电泳扩增以后共得到１７５０个有效片段用于埃及伊蚊的遗传特征分析,其中A G７㊁A C４㊁A C２引物扩增效果最理想,全部扩增出有效片段;
A C１引物扩增效果最差.扩增产物大小为９１~１９７b p之间.用G e n e M a k e r(v e r s i o n２．２０)对原始数据进行分析处理,检测数据和结果较多,分别选取２个位点的２个样本的系列图峰作为示例描述.图１分别是样本MH０６６位点A G１上的杂合子㊁样本R LＧC Q２３位点A C４上的纯合子.
２．３㊀微卫星遗传多样性㊀C T２位点未扩增出目的片段,其余１２对微卫星标记对５个不同地理位置:景洪㊁勐腊㊁勐海㊁瑞丽㊁耿马的埃及伊蚊自然种群进行扩增,共检测到２１６个等位基因,每个位点的等位基因个数为１０~３１个,所有位点的平均等位基因数为１８,有效等位基因为４．６５３个.其中,位点A G７和A G２的等位基因为３１个,等位基因数量最多;
位
(MH０６６A G１为杂合子,大小为１０７和１１４;R L C Q２３A C４为纯合子,大小为１１５和１１５)
图１㊀毛细管电泳荧光检测M H０６６A G１,R L C Q２３A C４微卫星标记
F i g．１㊀M i c r o s a t e l l i t e f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n o fM H０６６A G１
a n dR L C Q２３A C４
b y
c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s
点A G３的等位基因为１０个,数量最少.观测杂合度为０．５４８~０．９１０之间,平均值为０．７１１;期望杂合度为０．６２３~０．８２７,平均值为０．７２８.１２个多态位
９７１
２期郑宇婷,等:利用s s r标记浅析云南登革热重点地区埃及伊蚊种群遗传特征
点的多态信息含量范围为０．６１５~０．８８１,平均P I C 为０．７７８.其中A G１位点标记P I C指数最高为０ ８８１,A C１位点的标记P I C指数最低为０．６１５(表４).
从种群角度分析,平均每个种群的等位基因数在７．７５０~１０．５８３之间,等位基因数最多的是耿马,最少的是勐腊(表５).５个自然种群平均观测杂合度分布范围是０．６６１(J H)~０．７４１(M L),平均期望杂合度的分布范围在０．６２９(M L)~０．７７４(R L)之间.P I C指数最高是R L种群(０．７５０),最低是M L 种群(０．５８８)(表５).
２．４㊀遗传分化系数及基因流㊀１２个微卫星位点的群体内近交系数(F i s)有８个位点的杂合子过剩(F i s ＞０),４个位点的杂合子缺失(F i s＜０),F i s范围在０ ２２０~０．２０７之间,平均值为０．０２８,A C１和A G２位点的F i s和F i t值最高,分别为０．２０７㊁０．１３７和０ ２６０㊁０．２６７.说明这２个位点群体内近交程度较其他位点高(表６).
表４㊀１２个微卫星位点的总遗传参数
T a b．４㊀T o t a l g e n e t i c p a r a m e t e r s o f１２m i c r o s a t e l i t e l o c i l o c i N a N e H o H e P I C A G３１０３．２７８０．５７６０．６４９０．６５３A G７３１５．１２６０．７５７０．７９２０．８２４A G５１３３．１２００．５９３０．６５１０．６８３A C５１９５．５９７０．９０９０．８０４０．８８０A G１１６６．９０５０．７７００．８２７０．８８１A G４１６３．４２２０．７３３０．６８００．７５０A C４１２２．８０７０．５５２０．６２３０．７３１A T１１７４．１５８０．９０２０．７４１０．７８１A G２３１６．３９１０．６０７０．７０４０．８１４A C１１２３．４１８０．５４８０．６９００．６１５A C２２２７．１２７０．９１００．８０９０．８６２A C７１７４．４８７０．６６８０．７６００．８６２M e a n１８４．６５３０．７１１０．７２８０．７７８
表５㊀云南省５个埃及伊蚊自然种群１２个微卫星位点的遗传特征数值
T a b．５㊀N u m b e r o f g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s o f１２m i c r o s a t e l l i t e l o c i i n f i v e A e．a e g p y t i p o p u l a t i o n s
P o p u l a t i o n p a r a m e t e r A G３A G７A G５A C５A G１A G４A C４A T１A G２A C１A C２A C７M e a n J H N a６１４５１０１３４５６１４７７１１８．５００N e３．４８５６．４５３１．８８６５．４２６１１．２１５３．６４４２．５３０２．５１８７．２９３３．４０７３．１８７４．１２２４．５９７
H o０．６１５０．７８６０．４４４０．７８６０．８１５０．８０００．４３００．８５２０．６４３０．４４４０．７８６０．５３８０．６６１
H e０．７１３０．８４５０．４７００．８１６０．９１１０．７２６０．６１００．６０３０．８６３０．７０６０．６８６０．７５７０．７２５
P I C０．６７２０．８２８０．４３５０．７９３０．９０４０．６７４０．５６００．５３９０．８５００．６６００．６４５０．７３７０．６９１R L N a８１２６１３１１８８６２１９９１４１０．４１７N e４．９１５４．８２６２．９８８８．３６８６．４５２２．６２０４．２４３．７２９１１．８８４．３３３２．９８５６．３８３５．３０９
H o０．５０００．８０００．５８６０．８２８０．７６７０．６６７０．６０００．８９７０．８９３０．３８５０．８０００．６６７０．６９９
H e０．７９７０．７９３０．６６５０．８８００．８４５０．６１８０．７６００．７３２０．９１６０．７６９０．６６５０．８４３０．７７４
P I C０．７６８０．７７３０．６２７０．８６９０．８２７０．５９００．７３００．６８５０．９１００．７４４０．６２７０．８２８０．７５０MH N a８１３８１０１２８７９１０６１７９９．７５０N e３．３９６３．７５４．５５７４．２８６８．４９１５．１８７２．２５５．１４３２．５５４．１３８１０．００３．５０９４．７７１
H o０．７０００．５６７０．６３３１．００００．９０００．７６７０．４３００．９０００．５６７０．６３３１．００００．５６７０．７２２
H e０．７０６０．７３３０．７８１０．７６７０．８８２０．８０７０．５６００．８０６０．６０８０．７５８０．９０００．７１５０．７５１
P I C０．６６９０．７１７０．７５３０．７３７０．８７１０．７８１０．５２００．７７８０．５８４０．７１６０．８９２０．６７３０．７２４GM N a８１０９１４９１１９１２１４６１５１０１０．５８３N e３．０３５３．７５８３．４７５６．４０６５．１１４３．４９５２．８２０５．４７９８．９１１２．２４６９．６２６５．４０５４．９８０
H o０．６６７０．７６７０．６３３０．９３３０．７０００．７３３０．５７００．８６２０．７３３０．４１４０．９６７０．７６７０．７２９
H e０．６７１０．７３４０．７１２０．８４４０．８０４０．７１４０．６５００．８１７０．８８８０．５５５０．８９６０．８１５０．７５８
P I C０．６２４０．７１１０．６８５０．８２５０．７８１０．６６９０．６０００．７９７０．８７８０．５２３０．８８７０．７９３０．７３１M L N a５１４４８９５５１０７３１６７７．７５０N e１．５５７６．８４４２．６９５３．５０２３．２５５２．１６１２．２３．９２１１．３２５２．９６６９．８３６３．０１５３．６０６
H o０．４０００．８６７０．６６７１．００００．６６７０．７０００．７３０１．００００．２０００．８６２１．００００．８０００．７４１
H e０．３５８０．８５４０．６２９０．７１４０．６９３０．５３７０．５５０．７４５０．２４５０．６６３０．８９８０．６６８０．６２９
P I C０．３２３０．８３８０．５７６０．６６９０．６６３０．４６２０．４７００．７１７０．２３９０．５８９０．８９００．６２００．５８８０８１中国人兽共患病学报２０２１,３７(２)
㊀㊀按照B a l l o u x等[１７]的遗传分化的标准(低:０．１５~０．２５,中:０．０５~０．１５,高:０~０．０５),本研究群体间近交系数(F s t)平均值为０．０７８,为中度遗传分化.
云南５个埃及伊蚊群体N m均值为３．３２１,A G５位点上的基因流最大(５．２１０),A G２位点上的基因流最小(１．４１４).所有位点的基因流均大于１(表６).
表６㊀云南５个埃及伊蚊种群１２个微卫星位点上的
遗传分化系数和基因流的情况
T a b．６㊀N u m b e r o f F i s,F s t a n dN m o f１２m i c r o s a t e l l i t e s
i n f i v e A e．a e g p y t i p o p u l a t i o n s
L o c u s F i s F s t N m
A G３０．１１１０．０６０３．８９６
A G７０．０４４０．０５２４．５２９
A G５０．０９００．０４６５．２１０
A C５－０．１３００．０８７２．６２１
A G１０．０６９０．０８０２．８７３
A G４－０．０８００．０６０３．８８６
A C４０．１１３０．０８９２．５４４
A T１－０．２２００．０５４４．３９５
A G２０．１３７０．１５０１．４１４
A C１０．２０７０．０６８３．４３７
A C２－０．１３００．０７３３．１９５
A C７０．１２１０．１１９１．８５３
M e a n０．０２８０．０７８３．３２１
应用G e n A L E x软件中的M a n t e lT e s t检验埃及伊蚊种群间遗传分化和地理距离的相关性,地理距离(表７)由采样点经纬度计算得出,未发现相关性(y＝４E－０７x＋０．２５１１,R２＝０．２６３５,P＝０ １００).
表７㊀云南５个埃及伊蚊自然种群间地理距离(对角线之上)与遗传分化(对角线之下)矩阵表
T a b．７㊀G e o g r a p h i c a l d i s t a n c e(a b o v e d i a g o n a l)a n d
p o p u l a t i o n p a i r w i s eF s t s(b e l o wd i a g o n a l)
m a t r i x t a b l e i n f i v e A e．a e g p y t i p o p u l a t i o n s
P o p u l a t i o n J H R L MH GM M L
J H－３７５８０８．５８８３０４１６．１８９２２３８３９．９６２９８３２７．５８０R L０．０６３－３５５８９５．２６２１６８０５０．５４５４７４１２４．８７３MH０．０７３０．０８９－２１１０４６．３７７１２１３３３．８５２GM０．０９００．０６４０．０５７－３１９７７１．８４５M L０．１２６０．１４８０．０５８０．０９１－２．５㊀云南５个自然种群间遗传相似性指数和遗传距离㊀N e i s标准遗传距离在０．１６２~０．５２７之间,对应的遗传相似度在０．５９０~０．８５０之间(表８).
表８㊀５个埃及伊蚊种群N e i s标准遗传距离(对角线之下)
与遗传相似系数(对角线之上)
T a b．８㊀N e i s s t a n d a r d g e n e t i c d i s t a n c e(b e l o wd i a g o n a l)
a n d g e n e t i c s i m i l a r i t y c o e f f i c i e n c y(a
b o v e d i a g o n a l)
a m o n g f i v e A e．a e g p y t i p o p u l a t i o n s
P o p u l a t i o n J H R L MH GM M L
J H－０．７５９０．７４００．６７７０．６７５
R L０．２７５－０．６４２０．７３２０．５９０
MH０．３０１０．４４３－０．７７１０．８５０
GM０．３９１０．３１１０．２６０－０．７５４
M L０．３９３０．５２７０．１６２０．２８２－
勐腊与勐海群体的遗传相似度最高为０．８５０,遗传距离为０．１６２;勐腊与瑞丽群体的遗传相似度最低为０．５９０,遗传距离为０．５２７.
３㊀讨㊀论
５个埃及伊蚊自然种群的遗传多样性㊁生物多样性研究中遗传多样性的研究尤为重要,等位基因数㊁观测杂合度㊁期望杂合度和多态信息量等参数用于反映遗传多样性水平的重要指标,其值越大,说明基因丰富度越高㊁生物对环境的适应能力越强[１８].
本研究利用１２对微卫星分子标记对５个埃及伊蚊自然种群进行遗传多样性分析,１２个位点平均H o为０．７１１,平均H e为０．７２８,平均P I C为０．７７８,平均每个种群的等位基因数在７．７５~１０．５８３之间,表明各种群遗传多样性较高,与石清明㊁刘蓬勃等的研究结果项目一致[１９Ｇ２０].景洪㊁瑞丽㊁勐海㊁耿马㊁勐腊的平均H o分别为０．６６１㊁０．６９９㊁０．７２２㊁０．７２９㊁０ ７４１;平均H e分别为０．７２５㊁０．７７４㊁０．７５１㊁０．７５８㊁０ ６２９;平均P I C分别为０．６９１㊁０．７５０㊁０．７２４㊁０．７３１㊁０．５８８,杂合度代表基因多样度,在不考虑样本数量影响的情况下,反应群体在多个基因位点的遗传变异程度.本研究中景洪㊁瑞丽㊁耿马㊁勐海种群平均期望杂合度高于平均观测杂合度,意味着种群内可能存在近交;勐腊种群平均观测杂合度高于平均期望杂合度,意味着种群可能有大量外来个体的补充,或者可能经历了瓶颈效应或奠基者效应[１９].参照B o t s t e i n等提出的衡量基因变异程度高低的P I C指标,本研究５个种群P I C都大于０．５(平均为
１８１
２期郑宇婷,等:利用s s r标记浅析云南登革热重点地区埃及伊蚊种群遗传特征
０ ６９７),为高度多态.５个群体中瑞丽的P I C最高,表明呈现高度多态.
５个埃及伊蚊自然种群的遗传和亲缘关系群体内近交系数,其值越接近０,基因的分布越接近平衡,值为负时提示杂合子缺失,值为正时存在杂合子过剩[２１].基因在群体中的流动称为基因流,N m越大说明群体越均匀[２２],大于１则能够抑制群体间的分化[２３].
各种群的近交系数中勐腊F i s值为负,表示与其他种群近交程度很低,其他４个种群为正,说明这些种群中存在着不同程度的近交.５个自然种群的样本成对固定指数F s t均在０．０５７~０．１４８之间,表示种群间中度分化.基因流N m越大,群体间的相似性越大.５个自然种群１２个微卫星位点的平均N m为３．３２１,种群基因流较高,暗示５个群体间遗传交流水平高,能够抵制遗传漂变作用和防止种群分化的发生.与刘蓬勃[２０]㊁石清明等[１９]的研究结果一致.
遗传距离和相似度都是用来分析群体之间的亲缘关系,５个群体之间勐腊和瑞丽的N e i s遗传距离最大,遗传相似度最低,表明这２个群体的亲缘关系最远;勐腊和勐海的N e i s遗传距离最小,遗传相似度最高,说明这２个群体的亲缘关系最近.经计算５个自然种群的地理距离和遗传分化之间无显著相关性.
本研究采用微卫星标记技术对云南省５个埃及伊蚊自然种群进行遗传多样性分析,多样性指标P I C为０．５８８~０．７５０,呈现高度多态性,近交系数为０．０２８;遗传分化系数为０．０７８,基因流均值为３．３２１,表明群体间遗传交流水平高,存在一定程度的遗传分化.５个群体间的遗传距离为０．１６２~０．５２７之间,勐腊和勐海群体遗传距离最小,亲缘关系最近,勐腊和瑞丽的群体遗传距离最远,亲缘关系最远.景洪㊁瑞丽㊁勐海㊁耿马的埃及伊蚊种群存在着不同程度的近交,勐腊的埃及伊蚊种群可能经历过瓶颈效应或者有大量外来个体补充,还需要进一步确定.
利益冲突:无
引用本文格式:郑宇婷,姜进勇,周红宁,等．利用s s r标记浅析云南登革热重点地区埃及伊蚊种群遗传特征[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(２):１７６Ｇ１８２．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２１．００．０１４
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收稿日期:㊀编辑:王晓欢
２８１中国人兽共患病学报２０２１,３７(２)。