ABCC4 / MRP4 和 ABCC5 / MRP5 基因在NK/T细胞淋巴瘤的表达及与临床疗效的关系
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1 材料和方法
1.1 材料 RPMI-1640培养基购自Solarbio生物医药 公司；人AB型血浆由河南省中心血站提供； 重组新型人白介素-2注射液(欣吉尔)(IL-2)购自 北京双鹭药业股份有限公司；胎牛血清购自杭 州四季青生物工程材料有限公司；冰乙酸购自 武汉华顺生物技术有限公司；无水乙醇购自洛 阳市化学试剂厂；氯仿购自上海九邦化工有限 公司；DNA Marker DS2000购自TaKaRa生物公 司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成； 总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有 限公司；逆转录试剂盒试剂盒购自Fermentas公 司；荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生 物科技有限公司；一抗、二抗购自北京博奥森 生物有限公司。 1.2 细胞培养 正常NK细胞从本实验室健康者细胞提取， 生工生物工程(上海)有限公司培养，NK/T细胞 淋巴瘤SNK-6、YTS细胞株(本课题组实验室 保存)。正常NK细胞和SNK-6细胞：含10%的 人AB血清的RPMI-1640，1×107 IU/mL Il-2的 RPMI-1640；YTS细胞株：含10%胎牛血清的 RPMI-1640加1%的非必需氨基酸。所有细胞置 于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。 1.3 引物序列 引物设计：β-action、ABCC4/MRP4、 ABCC5/MRP5基因的引物设计参考国外研究 (表1)［10］。
《中国癌症杂志》2014年第24卷第1期
ห้องสมุดไป่ตู้
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CHINA ONCOLOGY 2014 Vol.24 No.1
ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因在 NK/T细胞淋巴瘤的表达及与临床疗效
的关系
李汝平 1 韩丽娟 1 张旭东 1 张明智 1 胡腾鹏 1 秦贝贝 1 文建国 2
1．郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052 ； 2．河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052
10
李汝平，等. ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞淋巴瘤的表达及与临床疗效的关系
表 1 ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因的引物序列
Tab. 1 Sequence of the primers and size of the product for ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene
通信作者：张明智 E-mail:mingzhi_zhang@
《中国癌症杂志》2014年第24卷第1期
多药耐药现象在各种肿瘤的化疗中普遍存 在，是导致肿瘤化疗疗效降低的主要原因之 一［1］。NK/T细胞淋巴瘤目前尚无疗效显著 的化疗方案，甚至有文献指出其对化疗抗 拒［2］，国内外文献报道该现象与药物耐药性 相关［3-4］。 NK/T细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的一个 亚型，发病率居T细胞淋巴瘤的首位，中国发病 率远高于西方国家，可发生于任何年龄。该病 具有起病隐匿、早期诊断困难、高度侵袭性、 进展速度快、生存期短、预后较差等特点，早 期采用放化疗，中晚期主要是采用化疗为主的 综合治疗，对化疗不敏感是治疗失败的主要 原因。 多药耐药相关蛋白(ABCCs multidrug resistance associated proteins，ABCCs/MRPs)是 一类跨膜转运蛋白，广泛分布于各种正常组 织，但表达水平相对较低，在炎症组织中稍增 高，但在肿瘤组织中呈高水平表达，除了具有 药物外排作用外，对正常细胞和恶性细胞的细 胞毒化合物也具有防护作用［5］。多药耐药相 关蛋白4(ABCC4 multidrug resistance associated protein，ABCC4/MRP)的基因定位于人染色体 13Ⅱ32，是转录编码该家族中分子量最小的 MRP蛋白，在人类正常组织及肿瘤中广泛表 达 ［6］。 其 能 够 识 别 和 转 运 与 谷 胱 甘 肽 偶 合的底物(如多柔比星、长春新碱和鬼臼 乙叉甙等)，作为转运体在肿瘤细胞化疗 耐 药 中 起 重 要 作 用 ［7］。 多 药 耐 药 相 关 蛋 白5(ABCC5 multidrug resistance associated protein，ABCC5/MRP)的基因定位于13q32 位置上，其表达蛋白由1 325个氨基酸组 成［8］。ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因有 36%的氨基酸是同源的，两者具有相似的底物 特异性，都可以介导Mg2+ATP依赖的cGMP和 cAMP的运输［9］。其中ABCC4/MRP4基因可以 调节各种抑制细胞生长药物、抗病毒药物、抗 生素及心血管药物在体内再分布和在肾脏的排 泄，在保护细胞和细胞信号传导通路中起关 键作用，ABCC5/MRP5基因介导生物细胞信号
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转导过程，对GSH及其化合物甚至重金属类 化合物都有运输作用。本课题组前期已通过数 字基因表达谱(digital gene expression，DGE)技 术和耐药相关基因PCR基因芯片技术检测发现 ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞 淋巴瘤SNK-6、YTS细胞株中的表达量相对正常 NK细胞较高，本研究将在基因、蛋白水平进行 检测和验证，同时结合临床资料回顾性研究分 析ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5蛋白在肿瘤组 织中的表达高低与疗效预后的关系。
［摘要］ 背景与目的：NK/T细胞淋巴瘤(natural killer/T cell lymphoma)疗效差，多药耐药 (multidrug resistance，MDR)的产生是引起肿瘤产生耐药和化疗疗效降低及失败的原因之一，本文通过研究 多药耐药相关蛋白4(ABCC4 multidrug resistance associated protein，ABCC4/MRP)基因和多药耐药相关蛋 白5(ABCC5 multidrug resistance associated protein，ABCC5/MRP)基因在NK/T细胞淋巴瘤SNK-6、YTS细胞 株和组织中的表达情况，结合临床疗效了解其与预后的关系。方法：应用实时荧光定量PCR(real-time PCR) 技术和免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因mRNA和蛋白表达 水平。结果：与正常NK细胞相比，ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在SNK-6、YTS细胞株中高表达(P<0.05)； 与鼻炎组织相比，ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞淋巴瘤患者组织中高表达(P<0.05)；ABCC4/ MRP4、ABCC5/MRP5基因表达量的高低和临床疗效呈负相关(P<0.05)。结论：ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5 基因及其表达蛋白影响NK/T细胞淋巴瘤的疗效。 ［关键词］ 多药耐药相关蛋白4基因；多药耐药相关蛋白5基因； NK/T细胞淋巴瘤； SNK-6、YTS细胞株 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2014.01.002 中图分类号：R733.4 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2014)01-0008-07
The expression of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene in the NK/T cell lymphoma and its relationship with clinical efficacy LI Ru-ping1, HAN Li-juan1, ZHANG Xu-dong1, ZHANG Ming-zhi1, HU Teng-teng1, QIN Bei-bei1, WEN Jian-guo2 (1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450052, China; 2.Institute of Clinical Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450052, China) Correspondence to: ZHANG Ming-zhi E-mail: mingzhi_zhang@ ［Abstract］ Background and purpose: Natural killer/T cell lymphoma in poor effects, the production of multidrug resistance is one of the reasons to reduce the chemotherapy effect or failure. This study aimed to discuss the multidrug resistance associated protein 4 (ABCC4/MRP4) gene and multidrug resistance associated protein 5 (ABCC5/ MRP5) gene expression in NK/T cell lymphoma SNK-6, YTS cell lines and NK/T cell lymphoma tissues, and the relationship between the level of ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene expression and the clinical efficacy. Methods: Real-time fluorescence quantitative PCR (Real time-PCR) and immunohistochemical method (IHC) were used to detect the ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene and protein expression. Results: Compared with the normal NK cells, ABCC4/ MRP4 and ABCC5/MRP5 gene in SNK-6, YTS cell lines were highly expressed (P<0.05); Compared with rhinitis tissues, the expression of ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene was higher in the NK/T cell lymphoma tissues (P<0.05); The expression level of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene was negative correlation with clinical efficacy (P<0.05). Conclusion: The expression of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene affects the of clinical efficacy of NK/T cell lymphoma. ［Key words］ ABCC4/MRP4 gene; ABCC5/MRP5 gene; NK/T cell lymphoma; SNK-6/YTS cell lines
Gene β-action
ABCC4/MRP4
ABCC5/MRP5
Sequence of the Primers(5’-3’) F: CAA GAT CAT TGC TCC TCC TGA R: AGT CCG CCT AGA AGC ATT TG F: GGA TCC AAG AAC TGA TGA GTT AAT R: TCA CAG TGC TGT CTC GAA AAT AG F: GCT GTT CAG TGG CAC TGT CAG R: TCA GCC CTT GAC AGC GAC CTT
1.1 材料 RPMI-1640培养基购自Solarbio生物医药 公司；人AB型血浆由河南省中心血站提供； 重组新型人白介素-2注射液(欣吉尔)(IL-2)购自 北京双鹭药业股份有限公司；胎牛血清购自杭 州四季青生物工程材料有限公司；冰乙酸购自 武汉华顺生物技术有限公司；无水乙醇购自洛 阳市化学试剂厂；氯仿购自上海九邦化工有限 公司；DNA Marker DS2000购自TaKaRa生物公 司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成； 总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有 限公司；逆转录试剂盒试剂盒购自Fermentas公 司；荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生 物科技有限公司；一抗、二抗购自北京博奥森 生物有限公司。 1.2 细胞培养 正常NK细胞从本实验室健康者细胞提取， 生工生物工程(上海)有限公司培养，NK/T细胞 淋巴瘤SNK-6、YTS细胞株(本课题组实验室 保存)。正常NK细胞和SNK-6细胞：含10%的 人AB血清的RPMI-1640，1×107 IU/mL Il-2的 RPMI-1640；YTS细胞株：含10%胎牛血清的 RPMI-1640加1%的非必需氨基酸。所有细胞置 于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。 1.3 引物序列 引物设计：β-action、ABCC4/MRP4、 ABCC5/MRP5基因的引物设计参考国外研究 (表1)［10］。
《中国癌症杂志》2014年第24卷第1期
ห้องสมุดไป่ตู้
8
CHINA ONCOLOGY 2014 Vol.24 No.1
ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因在 NK/T细胞淋巴瘤的表达及与临床疗效
的关系
李汝平 1 韩丽娟 1 张旭东 1 张明智 1 胡腾鹏 1 秦贝贝 1 文建国 2
1．郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052 ； 2．河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052
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李汝平，等. ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞淋巴瘤的表达及与临床疗效的关系
表 1 ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因的引物序列
Tab. 1 Sequence of the primers and size of the product for ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene
通信作者：张明智 E-mail:mingzhi_zhang@
《中国癌症杂志》2014年第24卷第1期
多药耐药现象在各种肿瘤的化疗中普遍存 在，是导致肿瘤化疗疗效降低的主要原因之 一［1］。NK/T细胞淋巴瘤目前尚无疗效显著 的化疗方案，甚至有文献指出其对化疗抗 拒［2］，国内外文献报道该现象与药物耐药性 相关［3-4］。 NK/T细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的一个 亚型，发病率居T细胞淋巴瘤的首位，中国发病 率远高于西方国家，可发生于任何年龄。该病 具有起病隐匿、早期诊断困难、高度侵袭性、 进展速度快、生存期短、预后较差等特点，早 期采用放化疗，中晚期主要是采用化疗为主的 综合治疗，对化疗不敏感是治疗失败的主要 原因。 多药耐药相关蛋白(ABCCs multidrug resistance associated proteins，ABCCs/MRPs)是 一类跨膜转运蛋白，广泛分布于各种正常组 织，但表达水平相对较低，在炎症组织中稍增 高，但在肿瘤组织中呈高水平表达，除了具有 药物外排作用外，对正常细胞和恶性细胞的细 胞毒化合物也具有防护作用［5］。多药耐药相 关蛋白4(ABCC4 multidrug resistance associated protein，ABCC4/MRP)的基因定位于人染色体 13Ⅱ32，是转录编码该家族中分子量最小的 MRP蛋白，在人类正常组织及肿瘤中广泛表 达 ［6］。 其 能 够 识 别 和 转 运 与 谷 胱 甘 肽 偶 合的底物(如多柔比星、长春新碱和鬼臼 乙叉甙等)，作为转运体在肿瘤细胞化疗 耐 药 中 起 重 要 作 用 ［7］。 多 药 耐 药 相 关 蛋 白5(ABCC5 multidrug resistance associated protein，ABCC5/MRP)的基因定位于13q32 位置上，其表达蛋白由1 325个氨基酸组 成［8］。ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因有 36%的氨基酸是同源的，两者具有相似的底物 特异性，都可以介导Mg2+ATP依赖的cGMP和 cAMP的运输［9］。其中ABCC4/MRP4基因可以 调节各种抑制细胞生长药物、抗病毒药物、抗 生素及心血管药物在体内再分布和在肾脏的排 泄，在保护细胞和细胞信号传导通路中起关 键作用，ABCC5/MRP5基因介导生物细胞信号
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转导过程，对GSH及其化合物甚至重金属类 化合物都有运输作用。本课题组前期已通过数 字基因表达谱(digital gene expression，DGE)技 术和耐药相关基因PCR基因芯片技术检测发现 ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞 淋巴瘤SNK-6、YTS细胞株中的表达量相对正常 NK细胞较高，本研究将在基因、蛋白水平进行 检测和验证，同时结合临床资料回顾性研究分 析ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5蛋白在肿瘤组 织中的表达高低与疗效预后的关系。
［摘要］ 背景与目的：NK/T细胞淋巴瘤(natural killer/T cell lymphoma)疗效差，多药耐药 (multidrug resistance，MDR)的产生是引起肿瘤产生耐药和化疗疗效降低及失败的原因之一，本文通过研究 多药耐药相关蛋白4(ABCC4 multidrug resistance associated protein，ABCC4/MRP)基因和多药耐药相关蛋 白5(ABCC5 multidrug resistance associated protein，ABCC5/MRP)基因在NK/T细胞淋巴瘤SNK-6、YTS细胞 株和组织中的表达情况，结合临床疗效了解其与预后的关系。方法：应用实时荧光定量PCR(real-time PCR) 技术和免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因mRNA和蛋白表达 水平。结果：与正常NK细胞相比，ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在SNK-6、YTS细胞株中高表达(P<0.05)； 与鼻炎组织相比，ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞淋巴瘤患者组织中高表达(P<0.05)；ABCC4/ MRP4、ABCC5/MRP5基因表达量的高低和临床疗效呈负相关(P<0.05)。结论：ABCC4/MRP4、ABCC5/MRP5 基因及其表达蛋白影响NK/T细胞淋巴瘤的疗效。 ［关键词］ 多药耐药相关蛋白4基因；多药耐药相关蛋白5基因； NK/T细胞淋巴瘤； SNK-6、YTS细胞株 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2014.01.002 中图分类号：R733.4 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2014)01-0008-07
The expression of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene in the NK/T cell lymphoma and its relationship with clinical efficacy LI Ru-ping1, HAN Li-juan1, ZHANG Xu-dong1, ZHANG Ming-zhi1, HU Teng-teng1, QIN Bei-bei1, WEN Jian-guo2 (1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450052, China; 2.Institute of Clinical Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450052, China) Correspondence to: ZHANG Ming-zhi E-mail: mingzhi_zhang@ ［Abstract］ Background and purpose: Natural killer/T cell lymphoma in poor effects, the production of multidrug resistance is one of the reasons to reduce the chemotherapy effect or failure. This study aimed to discuss the multidrug resistance associated protein 4 (ABCC4/MRP4) gene and multidrug resistance associated protein 5 (ABCC5/ MRP5) gene expression in NK/T cell lymphoma SNK-6, YTS cell lines and NK/T cell lymphoma tissues, and the relationship between the level of ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene expression and the clinical efficacy. Methods: Real-time fluorescence quantitative PCR (Real time-PCR) and immunohistochemical method (IHC) were used to detect the ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene and protein expression. Results: Compared with the normal NK cells, ABCC4/ MRP4 and ABCC5/MRP5 gene in SNK-6, YTS cell lines were highly expressed (P<0.05); Compared with rhinitis tissues, the expression of ABCC4/MRP4, ABCC5/MRP5 gene was higher in the NK/T cell lymphoma tissues (P<0.05); The expression level of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene was negative correlation with clinical efficacy (P<0.05). Conclusion: The expression of ABCC4/MRP4 and ABCC5/MRP5 gene affects the of clinical efficacy of NK/T cell lymphoma. ［Key words］ ABCC4/MRP4 gene; ABCC5/MRP5 gene; NK/T cell lymphoma; SNK-6/YTS cell lines
Gene β-action
ABCC4/MRP4
ABCC5/MRP5
Sequence of the Primers(5’-3’) F: CAA GAT CAT TGC TCC TCC TGA R: AGT CCG CCT AGA AGC ATT TG F: GGA TCC AAG AAC TGA TGA GTT AAT R: TCA CAG TGC TGT CTC GAA AAT AG F: GCT GTT CAG TGG CAC TGT CAG R: TCA GCC CTT GAC AGC GAC CTT