人全基因组全外显子组全外显子组和全转录组测序及其临床应用

1.无义突变（nonsense mutation）
即一个核苷酸突变后，产生了一个终止密码（stop condon），截断了转录和翻译，从而形成新的蛋白质分子。 新的蛋白质分子很可能丧失原来蛋白质分子的功能。
2.错义突变（missense mutation）
即一个核苷酸突变后，产生了一个不同的密码子，从而编 码出不同的氨基酸。根据该氨基酸对蛋白质空间结构的影响， 新的蛋白质功能可能保持或改变，因此错义突变又分为保守 突变和非保守突变。
人基因组中编码蛋白质的基因序列约占全基因组序列的 1.5%，有20 000～25 000个蛋白质编码基因，剩余的部分 包括RNA编码基因，调控序列与伪基因（pseudogene） 等，以及各种重复序列。重复序列占人全基因组的60%左右， 无转录活性，包括成簇存在于染色体特定区域的串联重复序 列（tandem repeat），
（二）基因（gene）
基因是具有遗传信息的DNA片段。通过转录形成功能RNA 分子。人的所有基因在23对染色体上呈线性排列，每一个 染色体含有数百个基因，大多数基因包含多个外显子 （exon），相邻外显子的中间是内含子（intron）。在基 因与基因之间，通常是调控序列和非编码的基因间片段（图 2-5-1）。
（三）结构性变异（structural variation,SV）
通常包括长度在50bp以上的DNA序列的插入、缺失、倒位、 重复，移动元件，染色体内部或染色体之间的序列易位，以 及更为复杂的组合变异。基因中出现这种变异，会影响转录、 翻译以及蛋白质分子结构和性质，乃至生物体的表型。
（四）拷贝数变异（copy number variation,CNV）
4）重复上面三个步骤，进行第二个碱基的信号收集，直至 完成所有循环。
（4）序列比对（sequence alignment）与数据分析（图 2-5-4A-d）
1）荧光信号数据分析：
将每个循环中拍摄的照片按时间顺序排列，然后对每个扩 增簇进行坐标定位，根据每个簇的颜色变化，进行碱基识别 并读取一条序列。读取序列的长度取决于测序的循环次数， 并用分析软件对每个碱基进行质量评估，给予每个碱基一个 质量分值（quality score，Q-score）。
人全基因组全外显子组和全转录组测序 及其临床应用
演讲人：卢老师
日期：2021.xx.xx
目录 CONTENTS
第一节 人全基因组、全外显子组和全转录组的基 本结构 第二节 人全基因组、全外显子组和全转录组测序 的基本原理和基本步骤及其检测报告
第三节 新一代测序与临床
第一节 人全基因组、全外显子组和全转录组 的基本结构
（二）全基因组重测序（resequencing）
参考基因组序列已知的物种的不同个体进行基因组测序， 然后在个体或群体水平上进行差异性分析的测序方法。将某 个体测序后获得的大量序列，与该物种的已知参考基因组序 列比对，可以确定该个体包含的各种类型的突变，包括单碱 基变异、插入缺失、结构变异及拷贝数变化。
提取基因组DNA，随机打断后，通过连接酶在每个DNA片 段的两端加上测序接头，经PCR扩增后，纯化并回收有接头 的DNA片段（图2-5-4A-a）。
（2）簇生成（cluster generation ）（图2-5-4A-b）NA后，引入流动槽，与流
1.全基因组重测序的两个前提条件 （1）已知该物种的参考基因组序列。 （2）所测定群体的个体之间遗传相似度很高（>99 %）。 2.全基因组重测序的基本步骤 以Illumina的双末端测序方法（pair-end sequencing）
on）：
而非编码外显子在转录并剪接后，不能翻译成蛋白质分子。 非编码外显子主要包括5'端的非翻译区（5'-UTR），3'端 的非翻译区（3'-UTR）。非编码外显子的主要功能是保持 mRNA的稳定性，延长其半衰期，并保证mRNA翻译过程 正确进行。
（四）内含子（intron）
基因中的非编码区可被转录，但是在mRNA加工过程中被 剪接，因此在成熟mRNA中并无内含子的编码序列。
（一）单碱基变异
（single nucleotide variation,SNV）
DNA分子中一个核苷酸被另外一个核苷酸替换而产生的变 异，又称点突变（point mutation）。按照碱基类型的变 化，单碱基变异可以分为转换（transition），即嘌呤和嘌 呤之间，或嘧啶和嘧啶之间的替换；置换 （transversion），即嘌呤和嘧啶之间的替换。按照核苷 酸突变是否引起蛋白质功能的相应变化，单碱基突变可分为 以下类型：
由于基因序列重排，导致1kb以上的大片段DNA的拷贝数增加 或减少。CNV的发生频率远远高于SNP，而且稳定并可遗传到 下一代，是导致人类疾病的重要分子机制之一。CNV通常是由非 等位基因同源重组（non-allelic homologous recombination，NAHR）所致。在同源重复序列之间，基因 发生大片段的结构变异和染色体重排，从而导致基因组的稳定性 下降，并诱发疾病。非同源重组也可以造成CNV，是较小片段的 CNV形成的主要机制（图2-5-3）。
图2-5-1 人类基因的结构及其转录和翻译示意
（三）外显子（exome）
人基因组中的外显子在转录并剪接（splicing）后，通过蛋 白质翻译过程表达为蛋白质。外显子分为编码外显子 （coding exon）和非编码外显子（noncoding exon） 两类。编码外显子是基因中的编码序列，经过转录并剪接后， 出现成熟的RNA分子即信使RNA（messengerRNA， mRNA），最后mRNA翻译表达为蛋白质。
动槽纳米孔表面的接头序列（adapter）杂交，固定在流动 槽的表面。
2）桥式扩增：
固定在纳米孔表面的DNA单链的另一端与纳米孔表面的相 应接头杂交，形成桥状结构。然后每条单链经DNA聚合酶 催化，合成互补链，形成桥式双链。双链再变性成两条单链， 进入下一个桥式扩增，重复多个循环后，每条单链扩增至上 千条，形成一簇。大量的簇在纳米孔表面的内壁上随机分布， 呈超高密度簇。
通过对个体间基因差异的分析对比，并结合不同个体的表 型，可做遗传进化分析，确定重要性状以及功能的相关基因。 近年来，随着二代测序技术的迅速发展和成熟，测序试剂成 本降低至1000美元以下，人全基因组重测序已成为研究人 类疾病快速有效的方法之一。可以在全基因组水平上检测与 疾病相关基因突变位点及结构变异等信息，开发精准治疗药 物。
四、基因突变
基因突变（gene mutation）是指细胞中的基因序列发生 碱基对组成、排列顺序以及拷贝数量的改变。基因突变可能 导致编码的氨基酸的变化，进而改变蛋白质的功能，引起生 物体表型变化。基因突变包括种系突变（germline mutation）和体细胞突变（somatic mutation）。种系 突变发生在生殖系细胞（精子和卵子）中，这类突变可传递 给后代；体细胞突变发生在体细胞中，体细胞突变不会遗传 给后师
日期：2021.xx.xx
一、人全基因组
（一）染色体
人类细胞核内有两套染色体，是“二倍体”（haploid）， 分别来自父母。人全基因组（human whole genome） 由23对染色体组成，包括22对体染色体，1条X染色体和1 条Y染色体。人全基因组约含30亿DNA碱基对，即60亿个 DNA碱基。DNA碱基包括胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸 腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）四种，它们通过氢键配对，G与 C通过三个氢键配对连接，A与T通过两个氢键配对连接。
如卫星DNA序列、微卫星等；分散于染色体各处的分散重 复序列（interspersed repeat），如DNA转座子 （transposons）、长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）、短分散重复序列（short interspersed nuclear elements，SINEs），以及长分散重复序列 （long interspersed nuclear elements，LINEs）。
伸。所用d NTP带有四种荧光基团之一和终止基团，因此每 个循环只能延伸1个碱基。洗去未结合的荧光标记的核苷酸。 2）荧光信号激发与采集：荧光基团经激光激发后，产生荧 光信号，用特殊相机拍摄。
3）末端切除：拍照后，用酶切除末端碱基的荧光基团和终 止基团。单链3'末端碱基不再产生荧光，恢复到可延伸的状 态。
SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP在人类基 因组中广泛存在，根据国际人类基因组单体型图谱 （International Hap-Map Project），任何两人之间 SNP平均差别有350万之多，约占整个双倍体基因组30亿 DNA碱基对的0.1%，平均1000个碱基对中有1个。单倍型 （hyploid genotype，haplotype），即单倍体基因型， 同一条染色体中一组相互关联的SNP或其他基因型通常一起 遗传。
通过确定单倍型，并对单倍型进行关联统计学分析，可以 探索疾病的基因基础。比如将患者与健康人（对照）的单倍 型进行比较，如果某一种单倍型在患者组与对照组的出现频 率有显著差异，那么影响该疾病的基因可能就与这个单倍型 密切相关。国际Hap Map计划的目的之一就是通过单倍型 图谱Hap Map，更多地了解常见疾病与基因的关系（图25-2）。
图2-5-2 人单核苷酸多态性和单倍体基因型示意
（二）插入与缺失突变（insertion and deletion,In Del）
1.插入突变（insertion） 一个基因的DNA中插入其他DNA片段，使基因序列发生变
化，改变其编码的蛋白质的结构，进而影响蛋白质分子的功 能。 2.缺失突变（deletion） 在基因中缺失DNA片段，改变基因编码的蛋白质分子的功 能。
3）单链化： 簇由DNA双链构成，定向切断接头序列上的 切割位点，产生一条单链，游离单链经碱变性后，冲洗去除。
4）末端封闭： DNA单链3'游离末端加上一个dd NTP， 封闭末端，以防测序时的随机延伸。
5）引物结合： 加入测序引物，与每条单链DNA的相应位 点结合。
（3）测序（图2-5-4 A-c）： 在Illumina测序仪上进行。 1）碱基延伸：将流动槽反应物转移到测序仪上进行碱基延
2-5-3
图 构 性 变 异人 示类 意基
因 结
第二节 人全基因组、全外显子组和全转录组测 序的基本原理和基本步骤及其检测报告
演讲人：卢老师
日期：2021.xx.xx
一、人全基因组测序
（一）全基因组从头测序（de novo sequencing）
如果某物种的参考基因组（reference genome）的序列 未知，对其全基因组进行序列测定，然后运用生物信息学， 对所得的大量序列进行拼接、组装，从而获得该物种的全基 因组序列图谱的测序方法称为全基因组从头测序。例如，通 过2003年完成的人类基因组计划，获得了第一个人的参考 基因组。
3.沉默突变（silent mutation） 一个核苷酸突变后，并没有密码子的改变，编码出相同的
氨基酸，并不影响蛋白质的功能。 如果在特定群体（population）中，某个单碱基变异的出
现频率超过1%，该单碱基变异就称为单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）。
二、全外显子组
全外显子组（whole exome）是人全基因组中所有外显子 区域DNA序列的集合。虽然人类全外显子组只占人类基因 组长度的1%～2%，但是85%以上因DNA变异引起的疾病， 是由于外显子组的变异。
三、全转录组
人全转录组（whole transcriptome）是在某一生理条件 下，人全基因组经过转录后，细胞内所有的转录产物，包括 mRNA、核糖体RNA（ribosome RNA，rRNA）、转运 RNA（transferRNA，t RNA）及非编码RNA（noncoding RNA）。狭义是指所有mRNA。转录组是基因组 遗传信息与生物体功能之间的桥梁。