内毒素检查方法

葡萄糖酸钙中细菌内毒素检查方法标准操作程序
1.目的：建立葡萄糖酸钙中细菌内毒素检查方法标准操作程序，规范操作。

2.使用范围：中心化验室
3.有关责任：中心化验室化验员对本规程实施负责，化验室主任对本规程的有效执行承担监
督检查责任。

4.程序：
本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断葡萄糖酸钙样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

内毒素的量用内毒素单位EU表示。

4.1.试验材料及工具
4.1.1分析天平
4.1.2电热干燥箱（180-300℃）
4.1.3恒温培养箱型号
4.1.4旋涡混合器
4.1.5微量移液器200~1000μl 50~200μl
4.1.6无热源吸头、大号、小号、试管架、封口膜
4.1.7鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号，我公司常用湛江安度斯）
4.1.8细菌内毒素检查用水（BET水）
4.1.9细菌内毒素工作标准品
4.1.10无热源的小试管10×75mm或无热源安培
4.1.11无热源的小试管15×100mm及无热源药匙
4.2操作方法
4.2.1实验准备
将所有玻璃器皿及药匙用洗液（包括三效灭活剂）渗泡4小时以上，用清水及纯化水冲洗后，置250℃烤箱中干燥60分钟以上或置121℃（蒸汽压力为0.105Mpa）热压灭菌1小时。

试验过程中应防止微生物的污染。

4.2.2葡萄糖酸钙样品的准备
精密称定样品0.0g~0.04g于无热源的15×100mm小试管中，加BET水稀释成0.01g/ml，在水溶中加热，置自动旋涡混合器中使样品溶解后，再至少混合30.秒（指原液C）。

例：样品重0.0220g，加（BET水）2.2 ml，使成0.01g/ ml。

4.2.3内毒素工作标准溶液的制备
取细菌内毒素工作标准品1支，加入1ml（BET水），用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后制成所需浓度的内毒素标准溶液（2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ）每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。

例：细菌内毒素工作标准品为50EU/支，加（BET水）1ml即50EU/ml，如实验要求鲎试剂灵敏度为0.25λ，那么细菌内毒素标准溶液应当为2×0.25λ=0.5λ，即0.5EU/ml.
应按以下方式进行稀释：
0.3ml 0.5ml 1ml 1ml
50EU/ml →5EU/ml →1EU/ml →0.5EU/ml →0.25EU/ml
2.7ml 2.0ml 1ml 1ml
4.2.4根据L值（限值），确定样品稀释倍数
有效稀释倍数=L/λ
例：L值为100EU/g，鲎试剂的灵敏度0.25EU/ml。

100EU/g- C 100EU/g- 0.01g/ml
有效最大稀释倍数=--------------- - ----------------------------- = 4倍
λ0.25EU/ml
即吸原液0.4ml × 4 = 1.6ml（总体积）
1.6ml – 0.4ml = 1.2ml（BET水）
4.2.5鲎试剂的准备
在制备内毒素的同时，取鲎试剂3支，按鲎试剂规格加入BET水复溶，轻轻转动瓶壁，使内溶物充分溶解，避免产生气泡，本公司所用规格为0.25EU/ml加水0.1ml复溶。

其中2支加入0.1ml按最大游戏稀释倍数的供试品溶液作为供试品管，1支加入0.1mlBET水，将细菌内毒素工作标准品制成的2.0λ浓度的内毒素溶液作为阳性对照管，1支加入0.1ml BET水作为阴性对照管，1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液（用被测供试品溶液将同1支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液）作为供试品阳性对照管，即（PPC管）。

加样结束后，封口，轻轻混合避免产生气泡，放入37±1℃的恒温装置内保温60±2分钟，保温和取试管过程中应避免受到振动造成假阴性结果。

结果判断：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-），应认为符合规定；如2支均为（+），应认为不符合规定；如2支中1支卫（+），1支为（-），按上述方法另取4支供试品管复试，，4支中1支为（+），即认为不符合规定。

阳性对照管为（-）或供试品对照管为（-），阴性对照管为（+），试验无效。

注意事项：新购入鲎试剂，BET水，细菌内毒素工作对照品都做鲎试剂灵敏度复核试验。