不同石蜡标本预处理方法对原位杂交检测子宫颈组织中HPV1618的影响

不同石蜡标本预处理方法对原位杂交检测子宫颈组织中HPV16/18的影响
徐明堂，何春年，赵焕芬，王树松，段国臣，张秀智
收稿日期：2012－05－10
基金项目：河北省卫生厅重点科研课题支持项目（20110011）作者单位：河北省人民医院病理科，石家庄050051
作者简介：徐明堂，男，副主任技师。

E-mail ：xmingtang@126．com 关键词：子宫颈病变；原位杂交；高压；高温；预处理；HPV 中图分类号：R 737.33；R 329-33文献标志码：B
文章编号：1001－7399（2012）12－1406－03
子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasias ，CIN ）由低级别演变为高级别、浸润癌的过程中，HPV 存在状态大多由游离型变为整合型
［1－4］。

因此识别HPV 的存在状态比确定其存在意义更重要。

而HPV 原位杂交信号的改变，
可以识别HPV 的存在状态［5，6］。

在观察病变组织形态学
的基础上，观察HPV 存在状态是形态学检测一个重要的补充。

本文采用酶消化与高压高温水浴法对病变组织做不同的预处理，探讨原位杂交检测HPV 存在状态的最佳方法。

1材料与方法1．1
材料
收集河北省人民医院病理科近年存档的手术切
除及活检子宫颈病变蜡块组织。

其中9例子宫颈癌，20例CIN3、15例CIN2、19例CIN1、10例正常组织。

原位杂交探针，选择高危型HPV16/18、地高辛标记DNA 探针（试剂盒购自北京中杉金桥公司，探针Lot ：9AP05.06）。

1．2方法
1．2．1
组织芯片的预备
据HE 染色的活检病理切片，确
定病变性质、类型，并与石蜡包埋组织核对，确定组织芯取材部位。

按以前描述的方法，
将试验组织芯集成一蜡块［7］
，形
成混合芯片（浸润癌、
CIN 和正常组织集成在一个芯片上），4μm 厚切片，
APES 载玻片附片，65ħ烤片过夜。

选取3个芯片，取1个行HE 染色，最终确定每一组织芯的病变性质，另2个芯片行原位杂交试验。

1．2．2
原位杂交
取2个芯片，常规环保液脱蜡，梯度乙醇
水化，0.3%双氧水10min ，蒸馏水浸洗2min ˑ3次。

预处理：一组进行酶预处理，即在去除多余水分后，0.4%胃酶（购自河北博海公司，产品：Sigma p7000）37ħ消化30min ，蒸馏水浸洗2min ˑ3次，然后梯度乙醇脱水。

每个芯片加探针液10μl ，盖玻片封盖，橡胶水泥封边，95ħ变性10min ，
37ħ过夜。

即试剂盒介绍的方法略改进。

一组进行高压高温预处理，即高压锅内加0.01mol /L 的枸橼酸抗原修复液（pH 6.0）750ml 加热至沸，
放入芯片，继续加热至喷汽，计时1.5min ；降温到压力消失时，取出芯片，蒸馏水浸
洗2min ˑ3次。

探针液95ħ水浴10min ，
芯片阴干，每芯片加变性探针液10μl ，盖玻片封盖，保鲜膜外包，
37ħ过夜。

杂交后洗涤与显色：杂交洗液37ħ作用15min ，PBS 液浸洗，
抗地高辛抗体37ħ作用30min ，PBS 液浸洗，链霉辣根过氧化物酶复合物37ħ作用30min ，
PBS 液浸洗；DAB 显色10min ；苏木精衬染（浅染），
常规脱水、透明，中性树胶封固。

先低倍镜或高倍镜下观察，然后油镜下观察。

1．2．3
HPV 存在状态判定、分布记录
细胞核内出现弥散、
多量黄褐色或黑褐色颗粒甚至核区呈黑褐色斑块均判定为HPV 游离态（图1A 、B ）。

核内出现散在黄褐色颗粒，且大小、数量在各细胞核内分布具有“一致性”，判定为整合态（图2A 、B ））。

两种情景并存者判定为混合态（图2C ）。

同一病变内，不论HPV 的存在状态如何，只要出现即为检出者（阳性）。

①A ①B
②A
②B ②C
图1
A 、
B 为同一CIN3病变，A 为酶法处理，多数核内保持了较多
散在分布的细小颗粒，胞间可见非特异性颗粒；B 为核内颗粒及胞间非特异性颗粒均减少图2浸润癌组织：A 、B 为HPV16/18整合型颗粒，是核内散在黄褐色或黑色颗粒，不同病变之间颗粒虽有大小之别，但同一病变内颗粒大小、数量在核内分布具有“一致性”。

A 为小颗粒，油镜；B 为大颗粒，高倍镜；C 为HPV16/18混合型，核内游离型与整合型颗粒同时存在，油镜
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1．2．4病变分层记录分别记录两组病变上皮组织的表层、中层及下层（相当基底层区域）HPV的检出情况。

1．2．5统计学处理对HPV16/18在不同预处理病变组织中分层检测、总检出率的差异进行χ2检验，其中正常组织，与CIN1 3组分层检测进行合并，α=0.05。

2结果
2．1两种预处理后HPV在正常及CIN中检出情况正常组织检测10例，CIN1检测19例，CIN2检测15例，CIN3检测20例。

经酶处理和高压高温法处理后，游离型HPV16/18于每种病变不同层次的检出情况均表现为从表层到底层检出例数逐渐减少（表1、2）；两种预处理的检出差异进行“行ˑ列”的χ2检验，差异无统计学意义（χ2=2.90，P＞0.05）。

整合型检出情况：酶处理CIN3有2例检出为整合型，高压高温法处理同样判定为整合型；高压高温法处理确定3例混合型（1例CIN1、2例CIN3），而酶处理均判定为游离型。

HPV16/18总检出率（游离+整合）酶处理组为53.1%、高压高温法处理组51.6%，两者比较接近（χ2=0.03，P＞0.75）。

游离型HPV16/18核内杂交体呈细颗粒状：酶处理及高压高温法处理，阳性病变大都表现为表层、中层阳性细胞内颗粒多（多者往往堆积成团块状，低倍镜、高倍镜均易见到）而底层阳性细胞减少，核内颗粒数减少；在同一病变内酶处理组核内颗粒数量普遍多于高压高温法处理组，但细胞间的非特异性颗粒也较多；而整合型颗粒高压高温法处理组因非特异性颗粒及游离型颗粒减少而更加突出，一般较游离型颗粒大，出现于CIN病变的中、低层（图3）。

③A③B
图3CIN组织：A．酶法处理胞间非特异性颗粒及核内游离型颗粒多而明显，整合不突出（↑）；B．为高压高温法处理，胞间非特异性颗粒减少或不明显，突出了整合型颗粒（↑）
表1胃酶组中游离型HPV16/18检测
类型n阳性表层中层下层
正常1022
CIN1196633
CIN21515833
CIN32016+2*161211
合计6434321817 *为整合型
表2高压高温组中游离型HPV16/18检测
类型n阳性表层中层下层
正常1011
CIN1198841
CIN2157+1＊＊842
CIN32012+2＊＊+2*1394
合计643330177＊＊为混合型，*为整合型
2．2两种预处理后HPV在浸润癌中的检出情况浸润癌组织9例：酶处理组、高压高温法处理组HPV16/18均阳性（表3）。

酶处理组2例游离型经高压高温法处理后，多数瘤细胞内HPV杂交颗粒明显减少，部分瘤细胞内颗粒消失，少部分瘤细胞仍保持较多颗粒数。

酶预处理组判定的3例混合型，经高压高温预处理后，核内游离型颗粒均减少，1例核内游离颗粒很难见到，判定为整合型。

在4例整合型癌组织中，2例颗粒较小（高倍镜下不易看到，油镜下观察），2例杂交颗粒较大（高倍镜下即可见到）；而两种预处理颗粒形态未见到明显区别，只是高压高温法处理组织细胞保持更好的形态。

表3浸润癌中HPV16/18检测
HPV类型胃酶法高压高温法游离型22
混合型2+1*2
整合型44+1*
合计99 *1例为酶预处理判定混合型，而高压高温法预处理后判定为了整合型
2．3两种预处理后整合型HPV的检出保持一致两种预处理HPV16/18皆为整合型的病变组织（2例CIN3、4例浸润癌），其核内颗粒均表现为散在分布、数量在细胞之间保持“一致性”。

3讨论
整合型HPV16/18是病毒DNA集成到宿主染色体DNA 分子当中，成为宿主染色体DNA分子的片段，其分布及数量将决定于在染色体上整合位点的数量及整合的染色体数，原位杂交一般显示为较大颗粒。

而游离型HPV16/18-DNA，与宿主染色体DNA未整合是游离体，在核内呈弥散分布，杂交显示核内弥散分布的小颗粒；在HPV拷贝数增多时，可由小颗粒聚集成大颗粒，直至成为斑块、团块状。

这种由游离型HPV小颗粒聚集成的大颗粒与整合型颗粒有时在大小、形态上难以区分；特别是混合型HPV感染的客观存在，即整合型HPV-DNA并存游离型HPV-DNA，整合型颗粒与游离型HPV聚集而成的较大颗粒的区别是困难的。

而HPV整合状态的出现与病变组织的恶性进展密切相关［2－4，6］，因此形态学基础上正确识别HPV的存在状态、特别是整合状态就显得尤为重要。

国外已有研究，用酶化学的方法通过去除蛋白
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质、RNA 及减少游离型HPV 存在，突出整合型HPV 存在［8］。

国内这方面的研究较少［9］
，本组实验用高压高温预处理的方
法，效果理想。

3．1
组织内HPV 经两种预处理都可得到良好显示
酶消
化法用胃酶消化蛋白质，以一种蚀刻的方式达到暴露HPV-DNA ，实现探针的组织渗透与结合。

而高压高温法是通过水介导的高压高温作用，使组织内蛋白及核酸变性，同时一些组织或细胞的结构成分弥散到水里，
加之水分子的水合作用，使组织细胞的微结构空间开放、伸展、暴露，同样实现探针的渗透与结合。

试验证明病变组织内HPV16/18经两种预处理后均显示为颗粒状（油镜下观察），其中游离型为细颗粒状，核区弥散分布，颗粒数少者寥若星辰，多者密集成片，
直至聚集成大颗粒状、团块状（高倍镜下甚至低倍镜即可观察）。

整合型为较大颗粒、核内散在分布，在同一病变组织内，
彼此大小也较一致，而不同病变之间颗粒往往有大小之别，大者高倍镜下即可观察到，小者需油镜下才易观察（这可能与不同病变组织染色体内整合的病毒拷贝数多少有关）；而核内的颗粒数，细胞之间一致性很强。

3．2
酶处理法更利于游离型HPV 颗粒的显示
本组把病
变上皮从底层到表层分3层，在32例HPV 阳性的病变组织内，游离型颗粒均表现为表层、中层细胞内多，而底层细胞内较少，甚至难以发现，这种分布特点导致表层检出多于底层检出。

但酶处理法在病变细胞核内保留了更多的游离型HPV 颗粒，而高压高温法在减少胞间非特异性颗粒及组织DAB 的非特异性着色的同时，也减少了核内游离型HPV 颗粒；结果导致酶处理法对病变底层HPV 检出多于高压高温预处理法。

在表层细胞核内由于存在更多的HPV 颗粒，经高压高温作用后仍有较多残余，并不妨碍HPV 存在的观察。

但两种预处理对病变各层检出及总的检出率（酶处理组53.1%，高压高温组51.6%），差异无显著性（P ＞0.05），说明对HPV 总检出率的影响无差别。

在浸润癌中经高压高温作用后，核内游离型HPV 颗粒也明显减少，同时也减少了阳性细胞数，这不利于浸润癌中游离型颗粒的发现。

3．3
高压高温法对检出整合型HPV 更显优势
对于
HPV16/18整合型病变，两种方法均可以很好的显示，2例CIN 和4例浸润癌在两种方法均显示为整合型；而对混合型HPV16/18，高压高温法显示出优越性。

3例混合型CIN 经高压高温作用后，胞间的非特异性颗粒及核内游离型颗粒减少或消失，
而大颗粒得以突显，且胞间数量保持一致性，从而支持这些颗粒为整合型；而酶消化法却因为核内较多的游离
型HPV 颗粒及胞间存在的非特异性颗粒（可能是黑色素颗粒或出胞的HPV 颗粒），不能排除这些较大颗粒是否是小颗粒聚集而成，故判定为游离型。

单纯的酶处理法保持了核内更多的游离型HPV 颗粒，特别是CIN 底层细胞、浸润癌细胞核内游离型颗粒的存在，有利于提高HPV16/18型的检出。

但高压高温法对整合型HPV16/18颗粒检出更具优势，通过减少核内游离型HPV 及胞间的非特异性着色，突出整合型颗粒的存在，有利于发现整合型HPV16/18。

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